Abstract
Makrofager spelar en viktig roll i värdförsvaret, förutom den kraftfulla förmågan att fagocytosera patogener eller främmande ämnen. De fyller en mängd olika roller vid immunreglering, sårläkning och bevarande av vävnadshomeostas. Makrofager kännetecknas av stor heterogenitet och kan polariseras i minst två stora extremer, makrofager av M1-typ (klassisk aktivering) som normalt härstammar från monocyter och makrofager av M2-typ (alternativ aktivering) som oftast är de vävnadsresiderande makrofagerna. Med utgångspunkt i sårläkningsprocessen i huden har tidigare studier dokumenterat hur dessa olika subtyper av makrofager deltar i vävnadsreparation och remodellering, medan makrofagernas mekanism för sårläkning i anastomoserna i tarmen ännu inte har fastställts. I denna översikt sammanfattas de för närvarande tillgängliga bevisen för de olika rollerna hos polariserade makrofager i det fysiologiska förloppet av anastomosläkning och deras patologiska roller vid anastomosläckage, den farligaste komplikationen efter gastrointestinal kirurgi.
1. Introduktion
Makrofager är myeloida immunceller som spelar en central roll i inflammation och värdförsvar . Dessa celler kännetecknas av den kraftfulla förmågan till fagocytos och har tillskrivits att skydda värden från infektioner genom en process som kallas ”medfödd immunitet” . Under de senaste åren har makrofagerna i takt med att bevisen har ökat framstått som en av de mest mångsidiga cellerna. Deras roller har förskjutits från immuneffektorceller som utför värdförsvaret bara som ”sopgubbar” till dominerande ”regissörer” och ”utförare” för att reglera inflammatoriska reaktioner, hålla vävnadshomeostas, delta i sårläkning och vävnadsremodellering .
Makrofager är aktivt involverade i sårläkningsprocessen, medan deras roll i ett särskilt kirurgiskt sår, även känt som anastomosesår, ännu inte har fastställts helt och hållet. Anastomosen konstrueras efter avlägsnande av gastrointestinal tumör eller tarmresektion av kirurger för att rekonstruera fortsättningen av mag-tarmkanalen. Onormal läkning av anastomosen kan utvecklas till anastomosläckage (AL), definierat som luminalt innehåll som läcker från en kirurgisk tarmförbindelse . Det är den farligaste komplikationen efter kolorektal kirurgi , eftersom den är ansvarig för upp till 40 % postoperativ dödlighet, förlängd sjukhusvistelse och en ökning av vårdkostnaden på grund av behandling av sepsis och behovet av reoperation .
Från en makroskopisk synvinkel omfattar orsaken till AL huvudsakligen kommunikation, infektion och läkningstörningar . En detaljerad mekanism på cellulär nivå har dock ännu inte fastställts på grund av de begränsade bevisen. Med utgångspunkt i heterogena populationer av makrofager och deras motsatta polariseringstendenser tenderar vi i denna översikt att diskutera olika typer av makrofager i en händelselös anastomosläkning och deras patologiska roller vid anastomosläckage.
1.1. Subtyper av makrofager
Makrofager eller mononukleära fagocyter hade länge ansetts härstamma från hematopoietiska stamceller (HSC). Enligt den rådande dogmen har alla makrofager härstammat från och även fyllts på av monocyter . Celler ur makrofagfamiljen (celler i det mononukleära fagocytsystemet) uppvisar dock en anmärkningsvärd heterogenitet, både när det gäller morfologi och biologiska funktioner . Dessa nya uppgifter har ifrågasatt den länge rådande uppfattningen om ”HSC-monocyter-makrofager”. Det har visat sig att vävnadsresistenta makrofager som Kupffer-celler i levern, epidermala Langerhans-celler i huden och mikroglia i hjärnan härstammar från en gulesäck och att de kan fortleva i vuxna möss oberoende av HSC . Dessa vävnadsresistenta makrofager kan förnyas in situ, även om de i vissa situationer också kan fyllas på av blodmonocyter. I motsats till monocytderiverade makrofager som deltar i en antibakteriell process under ett akut inflammatoriskt svar, uttrycker vävnadsresistenta makrofager olika funktionella egenskaper och spelar en central roll i upprätthållandet av vävnadsarkitektur, funktion och homeostas , och deras roll i anastomosläkning diskuteras vidare nedan.
Mångfalden och plasticiteten erkändes som kännetecken för makrofager, vilket bidrar till deras betydande heterogenitet. I allmänhet kan polarisering av makrofager delas in i två stora ytterligheter, det vill säga den klassiska aktiveringen som resulterar i makrofager av M1-typ (M1) och den alternativa aktiveringen som resulterar i makrofager av M2-typ (M2). Dessa två typer av makrofager utför olika funktionella fenotyper som svar på signaler från mikromiljön, såsom mikrobiella produkter, skadade celler och cytokiner från aktiverade lymfocyter. Särskilt kan ligander till tollliknande receptorer (TLR) och interferon-γ (IFN-γ) få makrofager att polarisera sig till makrofager av M1-typ, medan interleukin-4 (IL-4) och interleukin-13 (IL-13) tvärtom får makrofager att polarisera sig till makrofager av M2-typ. En sådan förklaring illustrerar dock kanske inte fullt ut alla olika aktiveringsscenarier. Murray et al. föreslog att det borde finnas några andra subtyper mellan M1 och M2 , inklusive M2a-undergruppen som induceras av IL-4 och IL-13, M2b-undergruppen som aktiveras av immunkomplex (TLR) och M2c-undergruppen som deaktiveras av glukokortikoider, transformationstillväxtfaktor (TGF) eller interleukin-10 (IL-10) . Det rapporteras också att det kan finnas en ytterligare subtyp av M2 (M2d) som aktiveras av TLR-agonister och adenosin . Det verkar som om polariseringen av makrofager bör ses som ett kontinuerligt spektrum, där två typer av makrofager (M1 och M2) upptar de motsatta ändarna. En annan klassificering av polarisering som föreslogs av Mosser och Edwards innebar att makrofager aktiveras för att bilda tre populationer som ansvarar för värdförsvar, sårläkning respektive immunreglering . Författarna klassificerade makrofagerna utifrån deras grundläggande funktioner snarare än utifrån stimuli. I överensstämmelse med den tidigare diskuterade uppfattningen om ”M1-M2”-paradigmet är de flesta monocytära makrofager klassiskt aktiverade och uttrycker M1-fenotypen, som utövar värdförsvar. Omvänt aktiveras vävnadsresidensmakrofager huvudsakligen på den alternativa vägen, som uttrycker M2-liknande egenskaper och bevarar vävnadshomeostasen och löser upp inflammationer .
1.2. Polariserade makrofagers roll i fysiologisk anastomosläkning
Den mag-tarmkanalens vägg innehåller fyra lager (dvs. mukosa, submucosa, muscularis propria och serosa). Vid en klassisk anastomos med inverterad tarm från ände till ände försvinner gapet mellan de två ändarna av mag-tarmkanalen genom att serosan appliceras, vilket ger en barriär som isolerar den sterila bukhålan från luminalt innehåll och bakterier. Submucosan består av blodkärl, lymfkärl och nervfibrer. Detta lager är källan till fibroblaster som blir aktiva efter gastrointestinal kirurgi och börjar deponera kollagen. De hopsatta eller suturerade kollagenfibrerna i detta skikt står för den största delen av anastomosens draghållfasthet ; därför är submucosan av stor betydelse för anastomosens läkning. Slemhinneskiktet spelar också en roll när det gäller att upprätthålla homeostas för att möjliggöra läkningsprocessen. En pool av makrofager i den gastrointestinala slemhinnan är den största poolen av vävnadsmakrofager i kroppen, och en långvarig frånvaro eller dysfunktion av makrofager försämrar den anastomosala läkningen .
Vävnadsreparation och läkning efter skada har studerats i århundraden men förblir förstådd till ett begränsat objekt, det vill säga huden. Till skillnad från detta är läkning av mag- och tarmkanalen anatomiskt sett inte möjlig att inspektera, vilket gör att kirurgen endast kan bedöma operationens framgång utifrån patientens parametrar för allmänt välbefinnande . Det finns vissa skillnader mellan huden och den anastomosala läkningen, bland annat när det gäller anatomi (t.ex. ingen motsvarande anatomisk komponent av serosa i kutana vävnader) och kollagen- och kollagenasaktivitet . Klassiska reaktioner på skador förekommer dock i alla organ och vävnader. Det fysiologiska förloppet av anastomosläkning kan också delas in i tre överlappande men distinkta stadier, som omfattar inflammation, ny vävnadsbildning och remodellering (figur 1) .
1.2.1. Inflammation
Inom infektion av olika mikrobiella faktorer kan skador eller trauman, t.ex. kirurgiska slag, också leda till en icke-patogenassocierad inflammation, som ytterligare kan delas in i den tidiga inflammatoriska reaktionen och den sena . I den tidiga inflammationsfasen rekryteras neutrofiler från cirkulerande blod till lokal sårvävnad (det anastomotiska området) först. Dessa rekryterade polymorfonukleära celler avlägsnar lokala främmande partiklar eller bakterier och genomgår sedan apoptos eller nekros. Därefter rekryteras monocyter och differentieras till makrofager som är mycket fagocytiska. De fagocyterar nedsatta neutrofiler och andra vävnadsrester för att skydda mot ytterligare vävnadsskador. Under denna fas, som svar på patogenassocierade modifierande mönster (PAMP) i en kontaminerande situation eller skadeassocierade modifierande mönster (DAMP) i en steril situation, aktiveras makrofagerna klassiskt sett och uttrycker M1-fenotypen . M1-makrofager frisätter höga koncentrationer av proinflammatoriska cytokiner såsom tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) och interleukin-12 (IL-12), proteaser och reaktiva syrearter (ROS), som alla anses vara viktiga för att döda mikrober och ge proinflammatoriska reaktioner . M1-makrofager kan också producera kollagenas, ett högaktivt enzym som orsakar kollagennedbrytning som resulterar i låg anastomosstyrka tidigt efter bildandet av en anastomos . I den sena inflammationsfasen, med överdriven fagocytos av apoptotiska neutrofiler, aktiverar de apoptotiska neutrofilernas engagemang av β2-integriner på makrofagerna makrofagerna att uttrycka den antiinflammatoriska mediatorn transforming growth factor (TGF) . Däremot hämmades produktionen av proinflammatoriska cytokiner som TNF-α och IL-1β . Makrofagernas fenotyp växlar således från proinflammatoriska M1-liknande till antiinflammatoriska M2-liknande. Dessa makrofager producerar cytokiner som IL-10 och lägger grunden för ny vävnadsbildning genom att utsöndra andra tillväxtfaktorer som vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) . Eftersom makrofager som stimuleras med IL-10, TGF eller glukokortikoider in vitro polariseras till M2c-subtypen som har likheter med antiinflammatoriska makrofager , tyder det på att antiinflammatoriska makrofager tillhör makrofager av M2c-typ och kan förstärka sitt antiinflammatoriska svar genom att utsöndra IL-10 och TGF i en feedforward loop. Dessutom har antiinflammatoriska och regenerativa förmågor hos antiinflammatoriska makrofager visat sig vara helt IL-10-beroende i sterila miljöer, t.ex. i kirurgiska sår .
1.2.2. Ny vävnadsbildning
I denna fas genererar makrofager som är bosatta i vävnad eller rekryterade från perifert blod, så kallade profibrotiska makrofager, olika tillväxtfaktorer såsom TGF, platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor-2 eller insulin-like growth factor-1 . Bland dessa är TGF en profibrotisk cytokin som verkar på fibroblaster och aktiverar dem att differentiera till myofibroblaster i sårvävnad. Myofibroblasterna producerar en massa extracellulära matrixkomponenter (ECM), inklusive kollagen och fibronectin, för att fylla ut vävnadsdefekten. I mag-tarmkanalen kan kollagen också produceras av glatta muskelceller . Kollagensubtyperna i mag-tarmkanalen är kollagen I, III och V, jämfört med enbart kollagen I och III i huden . Genom effektiva kontraktila krafter från myofibroblaster kan trasig sårvävnad bindas samman och återuppbygga sin integritet . Samtidigt släpper profibrotiska makrofager och aktiverade fibroblaster ut proangiogena faktorer som VEGF, som får endoteliska progenitorceller att krypa mot sårvävnaden för att främja nybildning av kärl (angiogenes). Invasionen av kapillärerna ökar blodtillförseln till lokala vävnader och underlättar anastomosaliknande läkning. Vidare visade studier av den läkande kolonslemhinnan hos kaniner efter experimentell excision att ett överflöd av mesenkymala celler i de läkande tarmmuskelskikten åtföljer kapillärinvasionen; dessa celler kan differentieras till glatta muskelceller och histiocyter, som tros vara ansvariga för återupprättandet av glatt muskelvävnad . Profibrotiska makrofager, myofibroblaster och nykärl utgör tillsammans granulationsvävnad, det viktigaste fundamentala kompartmentet i det normala förloppet av sårläkning . Dessa profibrotiska makrofager klassificeras funktionellt som M2a-lika makrofager eftersom de kan induceras in vitro av IL-4 och IL-13 . Det är dock inte klart om antiinflammatoriska och profibrotiska makrofager kan särskiljas tydligt in vivo, och det verkar som om makrofagernas plasticitet skapar en blandning eller kontinuerliga variantskiften under sårläkning .
1.2.3. Remodellering
Remodellering av anastomoser är en dynamisk mognadsprocess inom läkt vävnad som bygger på en balans mellan ECM-deposition och nedbrytning och vävnadsremodellering . En del av de vävnadsresiderande makrofagerna som kallas fibrolytiska makrofager är avgörande för att upprätthålla denna dynamiska balans. De producerar matrismetalloproteinaser som matrismetalloproteinas-2 (MMP2), matrismetalloproteinas-9 (MMP9), matrismetalloproteinas-12 (MMP12) och matrismetalloproteinas-19 (MMP19) för att bryta ned matrismakromolekyler, dvs. kollagen, som är en av de viktigaste komponenterna i ECM. Submucosan är ett hållfast skikt i mag-tarmkanalen och består huvudsakligen av kollagen, och remodellering av detta skikt dominerar anastomosens hållfasthet. Beroende på MMP som utsöndras av fibrolytiska makrofager omorganiseras och tvärbinds de ursprungligen deponerade kollagenfibrerna och ombildas från kollagen av typ III till kollagen av typ I. Det sistnämnda kollagenet är mycket starkare. Dessutom reglerar fibrolytiska makrofager också nedbrytningen genom att syntetisera TIMP (tissue inhibitor of metalloproteinases), som kan hämma MMP:s verksamhet. Dessutom är fibrolytiska makrofager ansvariga för induktion av fibroblastapoptos, efterföljande avlägsnande av apoptotiska celler och undertryckande av ytterligare inflammation via IL-10-frisättning . Fibrolytiska makrofager föreslås klassificeras som M2c-liknande makrofager som kan framkallas in vitro av apoptotiska celler och IL-10 .
Makrofagerna deltar alltså i hela det fysiologiska förloppet av anastomosläkning. Bland de tre huvudfaserna av vävnadsreparation uttrycker makrofager olika fenotyper under olika stadier. Det finns minst fyra typer av makrofager i ett tillstånd av normal vävnadsreparation: (1) proinflammatoriska makrofager, (2) antiinflammatoriska makrofager, (3) profibrotiska makrofager och (4) fibrolytiska makrofager. Om vi sorterar dessa fyra typer av makrofager enligt ”M1-M2”-paradigmet kan proinflammatoriska och profibrotiska makrofager motsvara M1-typ respektive M2a-typmakrofager. Samtidigt tillhör både antiinflammatoriska och fibrolytiska makrofager troligen makrofager av M2c-typ .
1.3. Makrofagernas roll i anastomosläckage
Som vi tidigare diskuterat i vår översikt innehåller förekomsten av AL huvudsakligen tre faktorer: kommunikation, infektion och läkningstörningar. Med kommunikation menas defekt i matsmältningskanalen i det anastomotiska området som förbinder de gastrointestinala lumina och bukhålan. Infektion innebär bakteriell infektion på det anastomotiska området. Läkningsstörningar omfattar alla ämnen som stör en normal läkningsprocess, t.ex. hypoxi eller inflammation. Dessa tre faktorer interagerar aktivt med varandra: om en faktor inträffar kommer en responskedja som består av alla faktorer att initieras och slutligen leda till AL. Till exempel framkallar en infektion ett inflammatoriskt svar på den anastomosala platsen, vilket försämrar kollagenavlagringen , stör sedan den normala läkningsprocessen och leder till en kommunikation mellan de intra- och extraluminala gastrointestinala väggarna. Tvärtom gör kommunikationen det möjligt för tarminnehållet (inklusive bakterier) att förskjutas in i bukhålan, vilket orsakar intraabdominell infektion och därefter fördröjer läkningen av anastomosen. Kliniskt sett betraktas kommunikation i viss utsträckning som ett makroskopiskt kliniskt resultat, medan infektion och läkningstörningar är varaktiga biologiska processer. För AL är makrofager huvudsakligen inblandade i de två sistnämnda mekanismerna, vilket också observeras i andra dåligt läkta sår .
Anastomosinfektion kan orsakas av anastomosdehiskens (tarminnehållet läcker ut till den sterila bukhålan) eller pre-/intraoperativ kontaminering. Oavsett orsaken till infektionen polariseras makrofagerna i den kontaminerande infektionsmiljön till M1-typen enligt ovan. I stället för att stödja motståndskraften mot intracellulära bakterier och kontrollera den akuta infektionsfasen är ett överdrivet eller långvarigt M1-program dock skadligt för patienterna, vilket visats vid akuta infektioner med Escherichia coli . E. coli, som är en bofast flora i tarmen, kan framkalla en typisk M1-profil genom att TLR4 känner igen lipopolysackarider (LPS). Klassiskt aktiverade makrofager av M1-typ uppreglerar uttrycket av inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS), som är ansvarigt för bildandet av kväveoxid (NO). NO identifierades först för att förmedla arteriell vasodilatation och visade sig sedan ha en roll i värdets försvar mot patogener . Dessutom har NO beskrivits spela en framträdande roll för kollagenavlagring, fibros och ärrbildning . Höga nivåer av NO i såret, som vid infektion eller inflammation, försämrar allvarligt sårets kollagensyntes . Minskad kollagenavlagring försvagar allvarligt den anastomotiska styrkan, vilket kan leda till att den anastomotiska läkningen misslyckas. Därför bidrar felaktig M1-polarisering av makrofager vid bakteriell infektion i bukhålan till förekomsten av AL.
Makrofagernas roll vid läckage med läkningstörningar är mer komplicerad. Under ett normalt tillstånd initieras vävnadsreparation från rensning av vävnadsrester och döda celler, effektiv fagocytosering av dessa ”vävnadsskräp” av makrofager, och är avgörande för snabb upplösning av inflammation och framgångsrik läkning. För de patienter som lider av diabetes mellitus, är äldre eller har genomgått kemoterapi är makrofagernas förmåga att fagocytosera allvarligt påverkad, vilket direkt leder till en ackumulering av apoptotiska eller nekrotiska celler vid anastomosstället. Denna ansamling av döda celler förlänger den inflammatoriska fasen, stör läkningsprocessen och äventyrar inflammationsupplösningen . Andra störningar, t.ex. ischemi eller hypoxi i anastomosen, äventyrar allvarligt läkningen av anastomosen. På cellulär nivå leder exponering av makrofager för en anoxisk miljö till uttryck av proinflammatoriska cytokiner som IL-1β och TNF-α och cytotoxiska mediatorer som NO , vilket tyder på att hypoxi kan främja att makrofager polariseras till M1-fenotypen. Överdrivet aktiverade M1-makrofager upprätthåller ett proinflammatoriskt svar och hindrar efterföljande steg i reparationsprocessen som påverkar korrekt läkning och remodellering av anastomosen , och den relevanta mekanismen beskrivs ovan.
Baserat på de tillgängliga bevisen verkar det som om klassiskt aktiverade makrofager som uttrycker M1-fenotypen är ansvariga för den patologiska processen med defekt anastomosläkning, medan alternativt aktiverade makrofager som uttrycker M2-fenotypen spelar en kritisk roll i inflammationslösning och framgångsrik vävnadsreparation (figur 2). Även om makrofager av M1-typ deltar i den tidiga fasen av normal sårläkning, lägger den programmerade omvandlingen av deras polariserade orientering från M1 till M2 grunden för det övergående inflammatoriska svaret och den efterföljande vävnadsregenerationen.
2. Slutsats
Makrofager är de mest mångsidiga immuncellerna och har en betydande plasticitet och heterogenitet. Makrofager kan polariseras i två huvudsakliga extremer och uttrycka motsvarande fenotyper (M1 och M2). Eftersom polarisering är förutsättningen för att makrofager ska kunna utöva sina olika biologiska funktioner spelar olika polariserade makrofager olika roller i den fysiologiska processen för anastomosläkning och patogenes av AL. Att återknyta AL till makrofagernas perspektiv bidrar till att utforska nya diagnostiska verktyg och terapeutiska mål. I olika återhämtningsfaser efter anastomoskonstruktion kan till exempel spektrumet av cytokiner och inflammatoriska mediatorer som IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, ROS och NO, som utsöndras av makrofager, uppvisa en förändring. Dessutom kan nivån av dessa ämnen indirekt återspegla situationen för en anastomos. En onormal fluktuation av dessa ämnen tyder troligen på störningar och brister i läkningen av anastomosen, vilket kan betraktas som ett förebud om AL. Eftersom makrofager av M1-typ visar en stimulerande effekt på AL och M2-makrofager är viktiga för anastomosläkning, kan reglering av M1/M2-polarisering hitta sina terapeutiska roller vid behandling av AL i framtiden.
Intressekonflikter
Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter i samband med publiceringen av denna artikel.
Författarnas bidrag
Jinyao Shi och Zhouqiao Wu är de första författarna.
Acknowledgments
Denna artikel stöds av Pekings kommunala vetenskaps- och teknologikommission (nr D141100000414004 och Z151100004015070) och Pekings kommunala kommission för hälsa och familjeplanering (nr 2014-1-2151).