Abstract
1992 rapporterade vi en ny metod för sekvensering av proteiner från carboxyterminus (C-terminus) (Boyd et al., 1992). Under de senaste två åren har vi fortsatt våra undersökningar, inklusive mekanismen för den inledande aktiveringen av den C-terminala karboxylgruppen och de avsiktliga modifieringarna av aminosyrornas reaktiva sidokedjor med sekvenseringsreagenserna. Genom valet av de reagenser och reaktionsförhållanden som används för vårt sekvenseringsprotokoll derivatiseras asparaginsyra, glutaminsyra, serin och threonin. Amidering av asparaginsyra och glutaminsyra och acetylering av serin och threonin har lett till bättre resultat vid sekvensering av dessa rester. Asparaginsyra och glutaminsyra kategoriseras nu, som framgår av tabell 1, som aminosyrarester som lätt kan sekvenseras. Vårt kriterium för att avgöra om en rest är tillförlitligt kallad är förmågan att sekvensera genom och detektera denna rest när den finns i en nanomol av ett proteinprov. I genomsnitt är det möjligt att sekvensera 5 cykler på en nanomol protein som appliceras på PVDF-membran (polyvinylidendifluorid) om aminosyresekvensen innehåller de rester som förtecknas i kolumnen ”tillförlitligt kallade” i tabell 1. Vårt fokus för MPSA-konferensen 1994 är att illustrera den nuvarande användbarheten av denna C-terminala sekvenseringsmetod vid sekvensering av proteiner som immobiliserats på PVDF.