RESULTAT
Identifiering av regulatoriska gener för djurpoldomänen (APD)
För att definiera det tidiga regulatoriska tillståndet för APD i sjöborreembryot använde vi oss samtidigt av bioinformatik och experimentella metoder för att identifiera gener som kodar för regulatoriska proteiner som uttrycks i denna poldomän före gastrulation. I den bioinformatiska metoden utnyttjades de ansträngningar för annotering av genomsekvenser som gjorts i vårt laboratorium (Burke et al., 2006) och i andra laboratorier (Howard-Ashby et al., 2006a; Howard-Ashby et al., 2006b; Materna et al., 2006; Tu et al., 2006), som dokumenterade APD-uttrycksmönster för många gener som kodar för transkriptionsfaktorer och/eller var ortologer av faktorer som är kända för att fungera i neurala vävnader hos embryon av andra arter. Den experimentella metoden jämförde representationen av RNA i Δcadherin mRNA-injicerade respektive normala embryon i blastula-stadiet. Embryon som saknar nukleärt β-catenin består nästan uteslutande av ektoderm från djurpolen, vilket visas av uttrycksmönstren för foxq2 och hbn. I normala embryon är dessa mRNA:er begränsade till djurpolen med början i blastulastadiet (Burke et al., 2006; Tu et al., 2006; Yaguchi et al., 2008) och områdena för deras uttryck i mesenkym-blastulastadiet överlappar varandra i djurpolen (fig. 1B-D). När utvecklingen fortskrider genom gastrulation bildar området medhbn-uttryckande celler en ring som omger celler som uttryckerfoxq2 (fig. 1F). När den kanoniska Wnt-, Nodal- och BMP-signaleringen elimineras genom injektion av ΔcadherinmRNA uttrycker djurhalvan av embryot foxq2 medan större delen av resten av embryot uttrycker hbn (fig. 1H). Dessa mönster visar att embryon som saknar kanonisk Wnt- och Nodal-BMP2/4-signalering nästan helt och hållet består av en dramatiskt expanderad APD, vars yttre gränser definieras av hbn-uttryck. Foxq2- och hbn-transkriptioner förekommer i APD under sena klyvningsstadier och tidiga blastulastadier, vilket tyder på att specifikationen av APD sker åtminstone vid denna tidpunkt.
Δcadherin-misexpressande embryon består av animal pole domain(APD)-vävnader som definieras av uttryck av foxq2 och hbn.Helmount in situ-hybridiseringar av embryon i mesenchym-blastula(A-D) och gastrulae (E-H) stadier. (E,F) Glycerol-injicerad kontroll. (G,H) Δcadherin-mRNA injicerat. (A, E, G) DIC; (B-D, F, H) Tvåfärgsfluorescens, hbn (grönt) och foxq2 (magenta) RNA. Skala: 20 μm.
För att identifiera tidiga APD-regulatoriska gener jämförde vi de relativa koncentrationerna av enskilda mRNA i Δcadherin mRNA- jämfört med glycerol-injicerade embryon i blastula-stadiet med hjälp av ett mikroarray som representerar alla genprediktioner som hittats i sjöborrens genomsekvens (Wei et al., 2006). Detta stadium markerar övergången mellan klyvning och morfogenesens början och är kort efter den tidpunkt då de tidigaste markörerna för APD har upptäckts (Burke et al., 2006; Howard-Ashby et al., 2006a; Howard-Ashby et al., 2006a; Howard-Ashby et al., 2006b; Tu et al., 2006; Yaguchi et al., 2008). En uppsättning gener som kodar för transkriptionsfaktorer och komponenter i signalvägar med ett genomsnittligt minst tre gånger högre uttryck i två omgångar avΔcadherin mRNA-injicerade embryon identifierades. Dessa överlappade delvis den uppsättning kandidatgener som identifierades genom den bioinformatiska metoden. De kombinerade uppsättningarna innehåller 27 gener och utgör en preliminär uppsättning APD-regulatoriska gener (E-APD) (tabell 1).
- Se inline
- Se popup
Känslighet hos gener i E-APD-uppsättningen för förlust av nuclearβ-catenin
För att identifiera de tidigast uttryckta generna inom E-APD-uppsättningen undersökte vi mikroarraygenererade tidsmässiga uttrycksprofiler enligt tidigare beskrivning (Wei et al, Mönstren verifierades genom jämförelse med publicerade data (Burke et al., 2006;Croce et al., 2006;Howard-Ashby et al., 2006a;Howard-Ashby et al., 2006b;Materna et al., 2006;Sweet et al., 2002;Takacs et al., 2004;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008) och med hjälp av våra in situ-hybridiseringar av helkroppar (våra opublicerade observationer). Generna sorterades in i tre grupper: de som var maximalt representerade i den moderliga RNA-populationen (fig. 2A), de som var starkt uppreglerade under klyvningsstadierna (fig. 2B,C) och de som var uppreglerade mellan sena klyvningsstadier och tidiga gastrulastadier (fig. 2D). Vi fokuserade först på medlemmarna i den tidiga embryonala uttrycksgruppen. Som framgår nedan identifierade vi med hjälp av både förlust- och gain-of-function-analyser en av dem, Sp-Six3 (nedan kallad Six3), som verkar i eller nära toppen av den APD-generatoriska hierarkin.
Six3 uttrycks tidigt i APD
Identifieringen av sjöborre Six3 är otvetydig eftersom dess sekvens är mycket välkonserverad i homeodomänen (98 % identisk med HsSix3), sexdomänen (91 %) och groucho-interaktionsdomänen (71 %) (se fig. S1 i det kompletterande materialet). Vi bekräftade tidigare studier som visar att Six3 uttrycks i ett dynamiskt mönster under utvecklingen avParacentrotus lividus (Poustka etal., 2007), en art som är nära besläktad med Strongylocentrotuspurpuratus som användes i denna studie. De viktigaste dragen är att Six3-transkriptioner uttrycks i djurhemisfären under den sena klyvningen (fig. 3A), i APD:n vid det kläckta blastulastadiet (fig. 3B) och sedan i två ringar (fig. 3G,H), en nära APD:ns periferi (fig. 3C-F,H) och den andra i endomesodermen (fig. 3C-G), under mesenchymets blastulastadium. Under gastrulation uttrycks Six3 i vissa sekundära mesenkymceller utspridda i blastocoel och vid spetsen av archenteron (Fig. 3I, pil), vilket rapporterats av Howard-Ashby et al. (Howard-Ashby etal., 2006b), i celler i djurpolen (Fig. 3I,J) och i oral ektoderm (Fig. 3J,K). I pluteusstadiet påvisas Six3 RNA i två kluster av celler som flankerar munnen (fig. 3K, pilar) och i det ciliatiska bandet (fig. 3K).
Six mRNA totala nivåer i tidigt mesenchym blastulastadium förändras inte signifikant vid injektion av Δcadherin mRNA (tabell 1). In situ-hybridiseringar stämmer överens med detta resultat och visar att fördelningen skiljer sig åt i Δcadherin mRNA-injicerade embryon, som är frånvarande från växtceller och behåller det breda uttrycket från djurhemisfären som etableras före restriktion genom processer som är beroende av kanonisk Wnt (se fig. S2 i det kompletterande materialet).
Six3-funktionen krävs för APD-bildning och differentiering av neuroner
För att testa Six3-funktionen injicerade vi två olika morfoliner som blockerar Six3-translation i befruktade ägg, som var och en gav upphov till samma utvecklingsdefekter. Embryon vid 3 dagar antog en rundad morfologi (Fig. 4A, B) och spikuler var antingen reducerade eller saknades. Djurpolens ektoderm saknade den förtjockade epitelmorfologi som är karakteristisk för djurplattan (fig. 4, jämför A,B med C,parentes). I vissa embryosatser skedde gastrulation normalt, även om den var försenad, och archenteronets position visade att oral/aboralpolariteten var etablerad (fig. 4A). I andra partier exogastrerade de flesta embryona. I embryon som saknade Six3 var den neurala differentieringen starkt hämmad, vilket visades genom immunfärgning för neurala markörer som normalt uttrycks under lategastrula- och pluteusstadierna (fig. 4, jämför A, B och C). Majoriteten (2/3) av embryona innehöll noserotonerga neuroner och resten hade ett reducerat antal (Fig. 4D) jämfört med det normala antalet i detta stadium (3-5). Samma sak gällde för alla andra neuroner, som undersöktes med den pan-neurala markören synaptotagmin (1e11) (Fig. 4A,B), som finns i APD och ciliatband hos normala tredagarsembryon (Fig. 4C). Betydande är att uttrycket av hbn reducerades till en nivå som inte kunde påvisas genom in situ-hybridisering (fig. 4F jämfört med fig. 4E). QPCR-mätningarbekräftade denna observation och visade att nivåerna av både hbn ochfoxq2 mRNA, som markerar de yttre gränserna respektive de inre delarna av APD:n, reducerades 8- till 10-faldigt i Six3-morfanter i themesenchyme blastula-stadiet (fig. 5).
Temporala uttrycksprofiler för gener i den preliminära tidiga APD-satsen. Profileringsmetoderna var de som beskrivs av Wei et al.(Wei et al., 2006). Värden vid olika timmar efter befruktning från 2 till 72 visas som en procentandel av den maximala signalintensiteten för varje gen vid 2-cell (maternellt RNA), 15 timmars tidig blastula (EB), 30 timmars sen mesenkymblastula (LMB), 48 timmars lategastrula (LG) och 72 timmars pluteuslarv (PL). Profilerna är grupperade enligt tidpunkten för det tidigaste påvisbara uttrycket: (A) maternell, (B,C) tidig blastula, (D) tidig blastula till mesenkymblastula. Den streckade linjens position representerar tidpunkten för analysen i Six3-morfanter. Data för Six3-genen är markerade med en röd pil.
Six3 krävs för uttryck av de flesta gener i E-APDset
Den slående fenotypen som produceras av förlust av Six3, liksom dess tidiga uttryck i embryot, föreslog att den skulle kunna fungera nära toppen av detAPD-genreglerande nätverket. För att undersöka denna möjlighet ytterligare använde vi mikroarrayanalys för att söka efter Six3-beroende gener vid 27 timmar, den tidpunkt då generna i E-APD-uppsättningen närmar sig maximala uttrycksnivåer. För att eliminera Six3:s endomesodermala funktioner utförde vi denna screening iΔcadherin-injicerade embryon. Som framgår av figur 5A eliminerade förlust av Six3 i dessa embryon helt utvecklingen av alla överflödiga neuroner som fanns i Δcadherin-injicerade embryon och det bildades inget förtjockat epitel, vilket återigen visar att Six3 har en viktig roll i APD-utvecklingen. Mikroarraydata identifierade ett överraskande stort antal genprediktioner (682) som var kraftigt nedreglerade (minst 4 gånger) i embryon som dubbelt injicerats med Δcadherin mRNA och Six3-MO, jämfört med embryon som enbart injicerats med Δcadherin mRNA. Mer än 60 % av alla gener i den tidigare mikroarray-screeningen som var uppreglerade minst 3 gånger iΔcadherin mRNA-injicerade embryon, och som därför sannolikt uttrycks i APD, var dessutom signifikant nedreglerade vid förlust av Six3. Viktigt är att mikroarray-data visade att majoriteten av E-APD-generna var känsliga för Six3 (fig. 5B, gul). I god överensstämmelse med detta visade QPCR-mätningar i två andra partier av embryon att endast fem E-APD-gener inte var signifikant beroende av Six3 (fig. 5B, röd, blå).
Six3 överuttryck är tillräckligt för att utvidga APD
Dessa resultat stöder starkt tanken att Six3 fungerar tidigt i APD-genernas regleringsnätverk, och ger upphov till möjligheten att det kan vara tillräckligt för att inducera andra celler i embryot att anta APD-öden.Masexpression av Six3 resulterade i embryon som uppvisade en extraordinär förändring i morfologi. Ett hästskoformat band av tätt packade celler sträckte sig i vegetal riktning från djurpolen (fig. 6, jämför B, C med A).Serotonerga neuroner, som normalt är begränsade till djurplattan (fig. 6D), ökade fyra gånger i antal och fördelades längs det täta bandet (fig. 6G). Dessutom liknar de neurala projektionernas form och arrangemang i celler som innehåller synaptotagmin (1e11) de som finns i djurplattan hos kontrollembryon (fig. 6E, vit streckad ruta jämfört med fig. 6H). Alla dessa celler innehåller i sina kärnor NK2.1 (fig. 6J-M, grönt), en transkriptionsfaktor som normalt uttrycks i djurplattan och den angränsande upra-orala ektodermen (fig. 6I, I′; gröna cirklar i fig. 6U), liksom några få celler i förloppet (Takacs et al., 2004). En kedja av 1e11-positiva neurala celler delar bandet i två delar (fig. 6K, röd) och celler på den inre sidan av det NK2.1-positiva bandet uttrycker också Gsc (fig. 6L,N, röd). Kombinationen av NK2.1 och Gsc markerar unikt det supra-orala ansiktsepitelet vid djurplattans orala kant (fig. 6I, I′, gula celler och fig. 6U, gula cirklar). Det expanderade bandets tätt packade kolonnceller omger mer platta epitelceller som uttrycker NK2.1, men inte Gsc (fig. 6M,N), precis som cellerna i de övre delarna av munnen hos normala embryon (fig. 6I, munnen, m). Ytterligare bevis för att dessa celler liknar de celler som finns nära munnen hos normala embryon är att de uttrycker hbn mRNA, som hos normala 3-dagarsembryon ansamlas runt djurplattans kant och sträcker sig in i den supra-orala ektodermen (fig. 1, fig. 6O). ISix3-misexpressande embryon är hbn-positiva celler koncentrerade i det tunna epitelet vid den vegetativa polen och befinner sig därmed i samma position i förhållande till den expanderade djurplattan och de Nk2.1-positiva cellerna i den övre förloppet som i normala embryon (fig. 6P,Q). Den sida som är motsatt den orala regionen differentieras som ett tunnskaligt epitel, uttrycker den aborala ektodermmarkören Spec1 (fig. 6R-T) och kan motsvara den hbn-positiva remsan av aboral ektoderm intill djurplattan. Sammantaget leder dessa genuttrycksmönster till den anmärkningsvärda slutsatsen att Six3 är tillräcklig för att omspecificera cellernas öden i större delen av resten av embryot och generera ett 3-dagarsembryo som består av en kraftigt expanderad, men korrekt mönstrad, djurpoldomän med oral/aboralpolaritet. APD i normala och Six3-misexpressande embryon markeras av de blå cirklarna i fig. 6U.
Helmontering in situ-hybridisering för Six3 mRNA underutvecklingen. Tidpunkter som timmar efter befruktning visas i det övre högra hörnet av varje bild. (A) Mycket tidig blastula. (B) Kläckande blastula. (C-H) Mesenkymblastula. (I,J) Lategastrula. (K) Pluteus. Alla embryon visas i sidovy, utom i G och H, som visar växtpolen (vv) respektive djurpolen (apv). Pilarna i I och K markerar positionerna för sekundära mesenchymceller respektive celler som flankerar munnen. Skala: 20 μm.
Förlust av Six3 resulterar i förlust av neuroner och det förtjockade epitel som kännetecknar APD. (A,B) Tredagarsembryon som injicerats med Six3-MO2 i encellsstadiet och som är typiska för starkare respektive svagare fenotyper. (C) Normalt tredagarsembryo. APD i A-C anges inom parentes; 1e11 (pan-neural, magenta), serotonin (grönt), DAPI (kärnor, blått). (D) Antal embryon som innehåller antingen 0, 1, 2 eller 3 serotonerga neuron per embryo i Six3-morfanter. I detta skede har normala embryon 3 till 5 serotonerga neuroner. (E,F)hbn mRNA i normala mesenkymblastulae (E) eller i Six3-morfanter (F). 20 μm.
Eftersom missexpressad Six3 kan expandera hela APD och främja utvecklingen av ektopiska neuroner frågade vi vilka gener i E-APD-genuppsättningen som var uppreglerade med hjälp av mikroarray- och QPCR-mätningar.Tabell 2 listar 10 sådana gener vars mRNA-nivåer är förhöjda minst 3 gånger i Six3 mRNA-injicerade embryon.
- Se inline
- Se popup
Gener uppreglerade i Six3-misexpressande embryon
Six3 kan undertrycka TGF-β-signalering men eliminerar inte oral/aboral polaritet
Six3-misexpression eliminerar inte oral/aboral polaritet eftersom markörer för oral ochaboral ektoderm uttrycks på motsatta sidor av embryot, och neuroner som normalt finns i APD är begränsade till ett mellanliggande band.Missexpressad Six3 minskar dock uttrycket av nodal samt av lefty och chordin i mesenchym-blastulae (tabell 3, vänster), kanske för att Six3 ger positiv input till uttrycket av FoxQ2, som har visat sig undertrycka nodal-uttrycket (Yaguchi et al, 2008).Överraskande nog undertrycker Six3 inte bmp2/4 mRNA-ackumulering lika mycket som det minskar nodal, trots att bmp2/4-uttryck kräver nodal funktion i normala embryon (Duboc et al., 2004). Denna skenbara paradox kan bero på en kombination av minskad Chordin-medierad hämning av BMP2/4-signalering i kombination med diffusion av BMP2/4 och efterföljandeautoaktivering, vilket har visats i andra system (Biehs et al, 1996;Jones et al., 1992).
- Se inline
- Se popup
Six3 reglering av komponenter i signalvägar
Känsligheten hos tidiga APD-regulatoriska gener för förlust av Six3. A) Tredagarsembryon som injicerats med Δcadherin mRNA (överst) eller medΔcadherin mRNA och Six3-MO (nederst). Pilen visar orienteringen av djur- och vegetalaxeln. Embryona är immunfärgade med anti-serotonin och1e11, en pan-neural markör. (B) QPCR-cykelförändringar (blå och röda staplar) eller log2-signalintensitetsskillnader (gula staplar) (y-axel, vänster) eller vikningsförändringar (y-axel, höger) i nivåerna av enskilda mRNA i två partier (röda och blå staplar) av Six3-morfant- och kontrollembryon efter 27 timmar, som båda innehåller Δcadherin. Gener varsuttryck förändras minst tre gånger står till vänster om den gröna linjen.
Kanoniska Wnt-, inte TGF-β-signaler förhindrar APD-utvidgning till den laterala ektodermen
Signalerna som avgränsar APD är beroende av den kanoniska Wnt-signaleringen, eftersom desseliminering gör det möjligt för APD att omfatta nästan hela embryot (Yaguchi et al., 2006) (fig. 1). Eftersom Nodal och BMP är beroende av kanoniska Wnt-signaler eliminerade vi båda TGF-β-liganderna med enNodal-MO (Yaguchi et al.,2008) för att testa om de var ansvariga för den Wnt-beroende begränsningen av APD. Fig.7B,F visar att detta inte är fallet eftersom serotonerga neuroner förblir begränsade till APD i dessa embryon. Men när Nodal-morfanter förses med exogent Six3 ökar de serotonerga neuronerna kraftigt i antal och uppträder i hela djurhalvan av embryot (fig. 7D), vilket observeras iΔcadherin-misexpressande embryon (Yaguchi et al., 2006), vilket gör att den kanoniska Wnt-signaleringen försvagas. Därför kan ektopiskt uttryck av Six3 åsidosätta de andra signaler, förmodligen Wnt, som begränsar dessa neuroner tillAPD i normala embryon.
Och även om serotonerga neuroner inte bildas i den laterala ektodermen hos Nodalmorphants, så gör vissa icke-serotonerga neuroner det (Fig. 7B). Detta beror främst, men inte uteslutande, på förlust av BMP2/4-signalering, eftersom samma resultat erhålls i BMP2/4-MO-injicerade embryon (S.Y., J.Y., L.M.A., R.C.Aand R.D. Burke, opublicerat). Eftersom utvecklingen av alla neuroner är beroende avSix3 i det normala embryot frågade vi om de ektopiska neuronerna i Nodalmorphants också är beroende av Six3 genom att samtidigt injicera Nodal-MO och Six3-MO. Som väntat försvann de serotonerga neuronerna som fanns vid djurpolen i Nodalmorphants i de dubbla morphants (fig. 7G,H). Dessa embryon innehåller inga differentierade icke-serotonerga neuroner med axonala processer, även om några 1e11-immunoreaktiva fläckar observerades. Dessa kan tyda på förekomsten av ofullständigt differentierade neuroner eller återspegla en initial neural bias hos ektodermceller som normalt åsidosätts av TGF-β-signalering.
Six3 kan motverka Wnt-signalering
Fakta att APD inte expanderar i Nodal-morfanter men gör det iΔcadherin-injicerade embryon och att Six3 kan övervinna de kanoniskaWnt-beroende effekterna i den laterala ektodermen väcker möjligheten att Six3 undertrycker Wnt-signalering. Till stöd för denna hypotes finner vi att Six3misexpression nedreglerar de flesta av de gener som kodar för Wnt-ligander som uttrycks under den tidiga utvecklingen (tabell 3, vänster) (fig. 8) En av dessa är Wnt8, en viktig vegetationssignal som krävs för normal utveckling av endomesoderm (Wikramanayake etal., 2004), ett resultat som stämmer överens med den uteblivna vegetationsutvecklingen i Six3-misexpressande embryon. Sammantaget tyder dessa resultat på att gränserna för APD bestäms av Six3/Wnt-antagonism.
Six3 räcker inte till för att undertrycka uttrycket av wnt ochnodal i APD
Förmågan hos Six3 att kraftigt nedreglera (direkt eller indirekt) gener som kodar för Wnt-liganderna, liksom för nodal, lefty och chordin, ger upphov till möjligheten att den normalt förhindrar uttryck av dessa gener i APD. För att utvärdera detta undersökte vi först effekterna av Six3 på genuttryck i Δcadherin-injicerade embryon för att eliminera eventuella motverkande effekter av Six3-funktionen i endomesodermen. Både mikroarray- och QPCR-data visar att Six3undertrycker uttrycket av Wnt-generna och nodal-, lefty- och chordin-generna i embryon som till största delen består av APD (tabell 3, fig. 8). I normala embryon (glycerolinjicerade) kan Six3-repression av dessa gener dock inte påvisas (tabell 3; fig. 8), vilket tyder på att ytterligare mekanismer skyddar APD från Wnt- och TGF-β-uttryck i det normala embryot.
Six3-reglering av andra signalvägar
Six3 reglerar också positivt (antingen direkt eller indirekt) gener som kodar för proteiner som fungerar i andra signalvägar (tabell 3). Dessa inkluderadeelta, Notch-liganden som förmedlar lateral hämning, en viktig process i neuronal utveckling, samt andra potentiella regulatorer av neurogensis. De senare inkluderar fgf9/16/20, fgfr-liknande, en membranbunden receptor som saknar tyrosinkinasdomänen, och frizzled5/8, en Wnt-receptor som kan förmedla icke-kanoniska signaler, men vars funktion i APD är okänd (Croce etal., 2006). I framtida studier kommer man att undersöka hur aktiviteterna hos dessa signalvägar och tidiga Six3-beroende transkriptionsfaktorer samverkar i APD:s genregleringsnätverk.
Misexpression av Six3 omvandlar embryot till en expanderad APD. Allembryon är 3 dagar gamla. (A) Normalt embryo, DIC; blastopore view, oralup. (B,C) Six3 mRNA-misexpressande embryon, DIC; (B)oral vy, (C) lateral vy; pilar i B visar gränsen mellan den expanderade djurplattan och det mer vegetabiliska tunna epitelet. (D,E) Serotonerga (sero, grönt) och alla (1e11, magenta) neuroner i normala embryon. (F-H) DIC- och immunanalyser, som i D och E av sex3 mRNA-misexpressande embryon; oral vy, djurpolen uppåt.(I,I′) Immunanalyser av normala tredagarsembryon för NK2.1 (grönt) och Gsc (magenta); (I) lateral vy; cellerna i APD till höger om den vita streckade linjen; (I′) oral vy, cellerna i APD ligger mellan de streckade vita linjerna. NK2.1-positiva celler markerade med pilspetsar befinner sig i blåskockan och är inte en del av APD; m, munnen. (J-T) sex3-mRNA-misexpressande embryon. (J,K) NK2.1 (grönt); 1e11 (magenta). (L-N) NK2.1 (grönt); Gsc (magenta). (O-Q) DIC-bilder av hbnwhole-mount in situ-hybridiseringar på kontrollembryon (O) och sex3mRNA-injicerade embryon (P,Q); djurpolen uppåt; den vita cirkeln i O markerar den södra delen. (R-T) En genom-fokal serie av ett embryo färgat med DAPI och för1e11 (grönt) och Spec1 (magenta) epitoper; Spec1 markerar den tunna, expanderadeaborala epidermis som kollapsar och rynkar sig under förberedelsen. (U)Diagram som illustrerar fördelningen av APD-celltyper i normala ochSix3-mRNA-misexpressande embryon. De färgade prickarna visar fördelningen av celler som uttrycker de angivna proteinerna eller mRNA:erna och svarta och lila ovaler visar serotonerga (Sn) respektive icke-serotonerga neuroner (n-Sn).Gröna och blå skuggor identifierar ansiktsepitel respektive ciliatband. Injektion av Six3 mRNA (pil) resulterar i ett sfäriskt 3-dagarsembryo (höger; se även B, C) som till stor del består av den region som är blåmarkerad i det normala embryot (vänster). I det Six3-mis-uttryckande embryot ökar antalet neuroner och NK2.1/gsc-positiva (gula; supraoral) celler kraftigt och dehbn-positiva cellerna (blå), som normalt flankerar djurplattan på den orala sidan i detta skede, återfinns vid den vegetala polen. Pilarna visar positionerna för de orala-aborala och animaliska-vegetala axlarna i både normala och Six3-misexpressande embryon. Skalstreck: 20 μm.