Strukturen hos ett membranadenylylcyklas som är bundet till ett aktiverat stimulerande G-protein

Membranintegrala adenylylcyklasser (AC) är nyckelproteiner i däggdjurens signaltransduktion, som reagerar på ett stort antal extracellulära och intracellulära signaler och genererar cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) för en rad signalhändelser i efterföljande led (1, 2). Membranens AC:er integrerar flera signalkaskader, t.ex. genom att koppla samman inflödena från G-proteinkopplade receptorer (GPCR), förändringar i intracellulära Ca2+-koncentrationer (3) och lipidsignaleringskaskader (4). Det finns nio AC-subtyper hos däggdjur, klassificerade som AC1 till AC9 (5). På grundval av aminosyrasekvensen har alla AC-subtyper samma övergripande förutsagda arkitektur. De är polytopiska membranproteiner som består av 12 transmembranhelixar (TM) och har cytosoliska N- och C-terminaler. De första sex TM-domänerna (TM1-TM6) i AC-polypeptiden följs av en cytosolisk region som innehåller en katalytisk domän (C1a), följt av en C1b-domän, den andra TM-regionen, TM7-TM12-bunten, och sedan en andra katalytisk domän (C2a) och en C-terminal C2b-domän. De N- och C-terminala delarna av proteinerna är mycket variabla, medan de mest bevarade delarna är C1a- och C2a-domänerna, som tillhör nukleotidylcyklaserna i klass III (5, 6). Röntgenkristallografi av en chimär AC5C1/AC2C2 i ett komplex med den stimulerande G-proteinunderenheten Gαs (7, 8) avslöjade de viktigaste egenskaperna hos det katalytiska AC-maskineriet och hjälpte till att formulera en detaljerad mekanism för cAMP-produktion av de G-proteinberoende AC:erna (7, 8). Var och en av däggdjursmembran-AC:erna innehåller dock ytterligare strukturella element, t.ex. den membranöverskridande domänen och den helikala domänen (HD), som är avgörande för att dessa proteiner ska kunna sättas samman på ett korrekt sätt och för deras enzymatiska funktion.

Med kloningen av den första däggdjurs-AC:n kom förslaget att AC:erna skulle kunna likna transportörer (9). Tidiga studier av ACs i Paramecium föreslog att TM-delen av proteinet kan ha en jonkanalfunktion (10). Sekvensen i Parameciums AC TM-del är homolog med sekvensen i spänningsstyrda kaliumkanaler (11), vilket stämmer överens med deras kanalfunktion. Förekomsten av ett polytopiskt TM-helixpaket och den cytosoliska adenosin 5′-trifosfat (ATP)-bindande domänen tyder på en ytlig strukturell och funktionell likhet med ABC-transportörer (ATP-binding cassette). Det finns dock ingen betydande sekvenslikhet mellan AC och några kända transportörliknande eller jonkanalliknande proteiner. Studier av AC från mykobakterier och däggdjur visade på en möjlig roll för TM-domänerna vid korrekt sammansättning av enzymet (7, 12, 13). TM-regionens strukturella och funktionella roll är dock fortfarande oklar.

AC9 är en cyklas-subtyp som uttrycks i många vävnader, inklusive lunga, hjärna och hjärta (14, 15). Den har studerats ingående tillsammans med AKAP-komplex (A-kinase anchoring protein) (16). Det har föreslagits att AC9 via AKAP Yotiao är kopplat till IKs-kaliumkanaler, proteinkinas A, fosfodiesteras PDE4D3 och proteinfosfatas PP1 (17). AC9 har identifierats som ett potentiellt mål för läkemedel vid astma (5). rs2230739, en polymorfism i AC9 som resulterar i en Ile772→Met-mutation, är förknippad med förändringar i svaret på den inhalerade kortikosteroiden budesonid (18). I en kanonisk modell för AC-aktivering binder forskolin till en allosterisk plats intill den katalytiska platsen, vilket leder till aktivering av enzymet. Interaktion mellan AC och Gαs-underenheten i ett guanosin 5′-trifosfat (GTP)-bundet tillstånd leder också till AC-aktivering, med maximal AC-aktivering i närvaro av både forskolin och Gαs-protein. Även om sekvensjämförelser med andra ACs visar att AC9 innehåller en allosterisk plats och en tidigare rapport tyder på att forskolin kan aktivera AC9 (14), har dock flera studier dragit slutsatsen att AC9 är forskolinokänslig och konsensus inom området har varit att AC9 står i en egen kategori som ett forskolinokänsligt protein (19, 20).

Ac-ämnena har länge förblivit en saknad bit i vår förståelse av signaltransduktion, möjligen på grund av de erkända svårigheterna att uttrycka och rena dessa proteiner för biokemiska och strukturella studier (21). För att fylla denna lucka bestämde vi strukturen hos bovin AC9 i komplex med Gαs (AC9-Gαs) med hjälp av kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) och analys av enstaka partiklar.

Vi uttryckte och renade bovin AC9 (fig. S1A) och bekräftade dess funktionella integritet med hjälp av cAMP-ackumuleringsanalyser (fig. 1, A till C). Det renade proteinet katalyserade omvandlingen av ATP till cAMP och kunde hämmas av MANT-GTP (2ʹ-/3ʹ-O-(Nʹ-metylanthraniloyl)guanosin-5ʹ-O-trifosfat), en hämmande AC-substratanalog (fig. 1B). Rekonstruktion av proteinet med den GTPγS-aktiverade Gαs (fig. S1, B och C) ledde till en robust aktivering av cyklaset (fig. 1A). Tester av förmågan hos den universella AC-aktivatorn forskolin att aktivera AC9 in vitro visade en mycket svag aktivering av AC9 vid submillimolära koncentrationer (fig. 1A). Däremot kunde forskolin aktivera AC9-Gαs-komplexet med en median effektiv koncentration (EC50) på 111 μM (fig. 1A och tabell S2). Även om både forskolin och Gαs-underenheten kunde aktivera proteinet delvis, kunde fullständig aktivering alltså endast uppnås genom att kombinera de två medlen. Dessutom, som förväntat av en allosterisk modulator av AC, försköt forskolin den mediana inhiberande koncentrationen (IC50) av AC9-substratanalogen MANT-GTP mot den lägre koncentrationen (fig. 1, B och C). Därför visar våra in vitro-experiment med renad fullängd AC9 och Gαs-protein tydligt att forskolin verkar på AC9-Gαs-proteinkomplexet som en klassisk allosterisk aktivator.

Vi framställde frysta, hydrerade cryo-EM-galler som innehöll AC9-Gαs-komplexet i närvaro av MANT-GTP och forskolin i koncentrationer (0,5 mM för varje ligand) som översteg IC50- och EC50-värdena för dessa två föreningar och utsatte dem för cryo-EM-analys av enstaka partiklar (fig. S2). Den bästa undergruppen av partiklar resulterade i en densitetskarta som motsvarar det kompletta komplexet av cyklaset och G-proteinunderenheten, förfinad till en upplösning på 3,4 Å (fig. 1D). Den kompletta densitetskartan, tillsammans med de kartor som erhållits efter fokuserad förfining av de membraninbäddade (fig. S3) och cytosoliska (fig. S3) delarna av komplexet, gjorde det möjligt för oss att bygga upp en komplett tredimensionell (3D) modell av AC9-Gαs-komplexet (fig. 1E). Kartan och modellen avslöjade flera nyckelelement i AC9-Gαs-komplexet: (i) AC9:s 12-TM-domänbunt, (ii) HD:n som förbinder TM-bunten och AC9:s katalytiska domän, och (iii) AC9:s katalytiska domän som är bunden till den GTPγS-aktiverade Gαs-underenheten (fig. 1, D och E, och fig. S6).

Proteinets TM-domän har en pseudo-tvåfaldig symmetri, en egenskap som ofta återfinns hos lösta transportörer i familjen för motståndsnoduleringsdivisionen, ABC, eller major facilitator (fig. 2, A till C). Transmembranhelikerna TM1-TM6 och TM7-TM12 kan överlagras med en medelkvadratavvikelse (RMSD) på 3,4 Å över 176 rester (fig. 2D). Den interna pseudosymmetrin stöder hypotesen att däggdjurens membran-ACs uppstod genom en genduplikationshändelse från ett enkelt system, möjligen liknande det i ”halvcyklaset” Cya/Rv1625c från Mycobacterium tuberculosis (12). Gränssnittet mellan de två TM-halvorna av AC9 bildas av spiralerna TM1, TM4 och TM6 i den N-terminala ”halvan” av TM-domänbunten och TM7, TM10 och TM12 i den C-terminala delen av proteinet (fig. 2, B och C). Kloningen av den första AC-genen från däggdjur åtföljdes av en antydan om att AC:er kan fungera som transportörer, baserat på deras primära sekvens (9). Vår struktur avslöjar inte någon uppenbar putativ väg för translokation av lösta ämnen inom TM-domänbunten, med TM-helixarna i AC9 packade tätt intill varandra. Även om en digitoninmicell sannolikt ger en miljö som liknar den i lipiddubbelskiktet, är det möjligt att TM-helixens konformation i membranets fysiologiska miljö är annorlunda.

De TM6- och TM12-helices av AC9 sträcker sig in i cytosolen och bildar 40-residue-långa HD:er som här kallas HD1 (inklusive helices h1.1 och h2.1) och HD2 (helices h2.1 och h2.2; Fig. 2, E och F). Denna region är viktig för AC:s och guanylylcyklasers funktion hos prokaryoter och eukaryoter (12). Resterna Leu323 till Met333 i helix h1.1 och Ile1022 till Leu1032 i helix h2.1 bildar en klassisk spiral (fig. 2F). Vi har tidigare beskrivit HD för Cya, en membran-AC från Mycobacterium intracellulare som är homolog till M. tuberculosis Rv1625c (12). HD:n för AC9 uppvisar vissa skillnader jämfört med Cya i det relativa arrangemanget av kärnregionen vid gränsen mot den katalytiska domänen (fig. 2, E och F, och fig. S7, A och B). I M. intracellulare Cya är de korta spiralerna tätt bundna vid den spiralformade spolens C-terminus (fig. S7B). Däremot avvecklas den spiralformade spolen i AC9 vid de C-terminala ändarna av h1.1 och h2.1 (fig. 2F, fig. S7B och fig. S8A). Denna region av enzymet är kritisk för ACs och guanylylcyklasers funktion. Mutationer som är kopplade till genetiska sjukdomar är kopplade till AC5:s HD:s vid familjär dyskinesi och ansiktsmyokymi (22, 23) och till retinal guanylylcyklas (retGC1) vid Lebers medfödda amauros-1 (24) och cone-rod dystrophy-6 (CORD6) (25). Vi kan nu förfina positionerna för de sjukdomsrelaterade mutationerna med hjälp av strukturen för AC9 från nötkreatur, som är en mycket närmare approximation av de mänskliga patologikopplade nukleotidylcyklaserna jämfört med M. intracellulare Cya.

Funktionen av 12-TM-bunten i däggdjurs ACs har varit oklar. Nyligen genomförda studier i den mykobakteriella Rv1625c föreslog en möjlig receptorfunktion för den membranöverskridande regionen i den mykobakteriella homologin (12). Vi kunde inte lösa upp delar av AC9:s extracellulära yta (fig. 2, A och B), och det är oklart om den membranbundna delen av proteinet hyser funktionellt relevanta bindningsställen för hypotetiska ligander. På samma sätt kunde C1b-domänen som förbinder den katalytiska domänen C1a med TM7 inte lösas upp i vår rekonstruktion (fig. S6, E till G). Vår struktur ger dock ledtrådar till hur interaktioner med den membranöverskridande regionen skulle kunna påverka proteinets katalytiska funktion. Helikerna TM6 och TM12 är kontinuerliga med h1.1 och h2.1 i HD. TM6 och TM12 är belägna vid gränssnittet mellan de helikala buntarna TM1-TM6 och TM7-TM12 och är lateralt exponerade mot lipidbilagret (fig. 2E och fig. S8B). Det är tänkbart att direkta interaktioner av TM6 eller TM12 med lipider, små molekyler eller andra proteiner direkt skulle kunna påverka den katalytiska domänen genom att ändra orienteringen av helices h1.1 och h2.1 (fig. S8B).

Den kompletta katalytiska domänen för AC9 består av två halvor, C1a och C2a (fig. 1E och 3A), vilket liknar de tidigare lösta röntgenstrukturerna av de lösliga domänerna för membran-ACs (fig. S7, A och C). Som tidigare visats bildas det huvudsakliga interaktionsgränssnittet mellan G-proteinets α-underenhet och AC9:s katalytiska domän genom att Gαs Switch II-helixen sätts in i det spår som bildas av helixerna α′2 och α′3 i AC9:s C2a-domän (fig. S7, D till F). HD-regionen h1.2 (rester 340-360) ligger i närheten av den Gαs-interagerande ytan (fig. S7E). Denna region av proteinet verkar vara mycket dynamisk, och vi kunde inte lösa upp de rester som förbinder His361 och Pro384 i AC9 (fig. S7E). Icke desto mindre tyder närheten av denna region till gränssnittet mellan G-protein och AC på att detta element i AC9-strukturen sannolikt bidrar till interaktionen mellan AC9 och Gαs.

Ett element med stark densitet som ligger inom ATP-bindningsstället och forskolinstället upptäcktes (fig. 3, A och B, och fig. S9, A till C). Denna täthet visade ytlig likhet med MANT-GTP-tätheten men motsvarade inte dess förväntade placering (fig. 3A). Tätheten i forskolinplatsen verkade överlappa den förväntade positionen för forskolin (fig. 3A). Ett liknande täthetsdrag fanns i kartan som rekonstruerades från bilder av provet utan forskolin (fig. 3B och fig. S9B). Oberoende av närvaron av MANT-GTP och/eller forskolin verkar därför de aktiva och allosteriska platserna vara upptagna av en täthet som överensstämmer med en peptid (fig. 3, A och B, och fig. S9, A och B). Fokuserad 3D-klassificering och förfining avslöjade en koppling mellan denna täthet och den C-terminala regionen av C2a-domänen av AC9 (fig. 3C och fig. S3 och S9C). Även om densitetsegenskaperna i denna mindre befolkade 3D-klass (SOL-C-kartan, beräknad med endast 16 343 partiklar) inte är tillräckligt starka för att med säkerhet bygga en atomär proteinmodell, kunde vi med hjälp av den tillgängliga densiteten som begränsning tilldela den till resterna Cys1246 till Pro1275 i AC9:s C-terminal, eller C2b-domän (fig. 3C och fig. S9C). Den höga kvaliteten på densiteten inuti den allosteriska och den aktiva platsen (fig. 3A och fig. S9, A och D) gjorde det möjligt för oss att bygga modellen av den ockluderande peptiden, som motsvarar resterna Ile1263 till Pro1275 i C2b-domänen av AC9 (fig. S9D). Denna region är starkt konserverad bland homologerna av AC9 hos vertebrater (fig. S9E) men inte hos de andra AC-isoformerna (AC1 till AC8) (fig. S10).

För att fastställa C2b-domänens funktionella roll i AC9 jämförde vi de enzymatiska egenskaperna hos vildtypen och det trunkerade proteinet utan C2b-domän AC91250 (fig. 3D och fig. S11A). De två konstruktionerna visade jämförbar förmåga att omvandla ATP till cAMP, med liknande Michaeliskonstant (Km) och Vmax-värden (fig. 3E och tabell S2). AC91250 aktiverades av forskolin och hämmades av MANT-GTP på ett liknande sätt som AC9 (fig. S11, B till D). Tillsats av Gαs stimulerade potent cAMP-produktionen av AC9 (fig. 3F), med en samtidig ökning av dess Km för ATP. I överensstämmelse med att svansen hämmar ATP-bindningen visade AC91250 en hög Vmax men vid ett mycket lägre Km-värde (fig. 3F). Detta är en stark indikation på att C2b-regionen spelar en funktionell roll i AC9:s G-proteinbundna tillstånd. Borttagande av C2b-regionen ökar AC9:s affinitet för ATP i närvaro av Gαs, vilket gör det möjligt för proteinet att nå maximal katalysationshastighet vid mycket lägre ATP-koncentrationer. Minskning av affiniteten för substratet (ATP) genom ocklusion av den aktiva platsen genom C2b-domänen kan utgöra en regleringsmekanism för att kontrollera cAMP-produktionen av det G-proteinbundna AC9.

För att bedöma konformationsförändringarna i AC9:s ockluderade tillstånd bestämde vi kryo-EM-strukturen av AC91250-Gαs-komplexet i närvaro av MANT-GTP och forskolin (AC91250-Gαs-MF; fig. 3, G och H, samt fig. S12 och S13). Rekonstruktionen med en upplösning på 4,2 Å gjorde det möjligt för oss att tydligt lösa upp densiteten för MANT-GTP och forskolin bundna vid deras kanoniska bindningsställen (fig. 3, G och H, och 4; fig. S13, E till G). En jämförelse av det katalytiska domänarrangemanget i AC91250-Gαs-MF- och AC9-Gas-komplexen avslöjade en liten relativ omarrangemang av C1a som är beroende av närvaron av den ockluderande peptiden i de aktiva och allosteriska platserna (fig. 4, A och B; RMSD mellan atomerna i de rörliga C1a-domänerna (Ile1380 till Gln574) i de två jämförda strukturerna som anpassats med hjälp av deras C2a-domäner (Gln1049 till Lys1245) är 1,9 Å. Den subtila rörelsen av hela domänen som observerats i det ockluderade tillståndet hos AC9 förskjuter aminosyraresterna i C1a som är involverade i nukleotidbindning med ~3 Å (fig. S13H). Därför antar den centrala katalytiska domänen av AC9 en ockluderad konformation, där den C2b-avledda peptiden ockuperar proteinets aktiva och allosteriska platser (fig. S9, D och E) tillsammans med en förvrängning av den aktiva platsen jämfört med den som observerats i MANT-GTP- och forskolinbundet tillstånd.

Strukturen av AC9-Gαs-komplexet i en ockluderande konformation gjorde det möjligt för oss att ompröva den etablerade modellen för cAMP-baserad signaltransduktion (7, 26) (fig. S14). Aktivering av GPCR-kaskaden måste leda till att den Gαs-underenhetsbundna formen av AC bildas för att generera cAMP. Det ockluderade tillstånd som beskrivs här lägger dock till en intermediär som tidigare inte har uppskattats. Det ockluderade tillståndet och det aktiva tillståndet hos AC9 existerar sannolikt i en jämvikt; det prov som producerade rekonstruktionen av det ockluderade tillståndet kan aktiveras av G-protein och kan producera cAMP. Proteinets avsevärt minskade Km för ATP (fig. 3F) tyder ytterligare på att ocklusion av ATP-platsen kan gynnas i närvaro av G-proteinet. Framtida experiment kommer att bidra till att definiera den funktionella rollen för denna proteinkonformation i den katalytiska cykeln hos AC9.

Arkitekturen hos AC9 som avslöjats i denna studie ger ledtrådar till den möjliga rollen för de membraninbäddade delarna i däggdjurs ACs. En uppenbar funktion för membrandomänen är att möjliggöra en korrekt sammansättning av det aktiva cyklaset. Detta åstadkoms genom att TM6 och TM12 tillhandahåller ramen för HD. Det är troligt att de delar av proteinet som för närvarande inte kan upplösas, dvs. N-terminus och C1b-domänen, bidrar till sammansättningen och regleringen av AC9:s cyklasfunktion (fig. S6, E till G). Trots att den katalytiska domänen är separerad med ~40 Å från lipidbilagan är det därför tänkbart att membrandelen av proteinet kan påverka den katalytiska domänen via HD och de loopregioner som gränsar till den.

Det ockluderade tillståndet hos komplexet med den C-terminala peptiden som binder både den aktiva och den allosteriska platsen hos AC9 kan representera en viktig autoreglerande mekanism som är inbyggd i det AC-baserade signaltransduktionsmaskineriet. Närvaron av peptiden kan bidra till att förklara de inkonsekventa observationerna av forskolins okänslighet hos AC9 (14, 19, 20), vilket stöder kontextberoende autoreglering av AC9. Forskolin är en växtbaserad småmolekylär aktivator av ACs; den naturliga aktivatorn eller hämmaren av denna plats i ACs har postulerats existera (20) men har hittills inte identifierats. När det gäller AC9 kan vi nu visa att i) forskolin kan aktivera enzymet och ii) den troliga naturliga regulatorn av den allosteriska platsen är den del av C2b-domänen som binder till proteinets aktiva region. Vi föreslår att C2b, efter aktivering av G-proteinet (fig. S14, A till D), ockluderar AC9-reaktionscentret och blockerar den enzymatiska aktiviteten, vilket förhindrar överdriven produktion av cAMP i cellen (fig. S14E). Detta stämmer överens med en färsk rapport om den autoinhibitoriska funktionen hos AC9 C2b-domänen i ett cellulärt sammanhang (27). Våra fynd kan bidra till att bana väg för att generera nya tillvägagångssätt vid upptäckt av läkemedel som utnyttjar den autoreglerande molekylära mekanism som avslöjas av AC9-Gαs struktur.