TEXT
Humana influensavirus infekterar vanligen de övre luftvägarna och orsakar nysningar, rinnande näsa och hosta samt feber, illamående och artralgi (22). Dessutom har neurologiska komplikationer också rapporterats när en ny subtyp av influensavirus introduceras i den mänskliga befolkningen, vilket exemplifierades av de spanska (1918) och asiatiska (1957) pandemierna (2-4, 6, 10, 18, 22).
År 1997 orsakade H5N1-influensaviruset, som härstammar från fjäderfä, ett utbrott hos människor. Sedan dess har mer än 500 personer smittats av H5N1-virus världen över, med en dödlighet på cirka 60 % (21). Infektion med H5N1-virus hos människor yttrar sig i allmänhet i form av allvarlig lunginflammation som utvecklas till akut andningsnödsyndrom, men vissa offer för H5N1-virus har drabbats av neurologiska problem (1). H5N1-virus-RNA och antigener har påvisats i hjärnor hos patienter, och själva viruset har isolerats från cerebrospinalvätska (5, 7). Dessa uppgifter tyder på att vissa H5N1-virus kan orsaka hjärninflammation hos människor, vilket inträffade i de tidiga faserna av de spanska och asiatiska pandemierna.
Frätter utgör en användbar däggdjursmodell för influensainfektion eftersom de är mycket mottagliga för infektion med influensavirus och utvecklar några av de symtom på influensa som ses hos människor (8, 12, 14, 16, 19). Neuroinvasivitet hos ett H5N1-influensavirus efter intranasal exponering har också rapporterats i en illermodell (23). För att studera de långsiktiga neurologiska effekterna av H5N1-virusinfektion infekterade vi därför illrar med H5N1-virus som orsakar milda symtom hos dessa djur och observerade effekterna på det centrala nervsystemet (CNS) under 9 månader. Vi försökte också klarlägga på vilket sätt dessa H5N1-virus invaderade CNS.
Sex månader gamla illrar inokulerades intranasalt med 106 PFU av A/Hong Kong/483/1997 (H5N1; HK483) eller A/Hong Kong/486/1997 (H5N1; HK486) virus. Dessa virus förökades i Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler i minimalt essentiellt medium kompletterat med 0,3 % bovint serumalbumin. Dagarna 3, 6 och 12 samt månaderna 1, 3, 6 och 9 efter infektionen (p.i.) tog vi vävnadsprover för virusisolering och patologisk undersökning. Illrarna var slöa och uppvisade tecken och symtom på luftvägsinfektion under de första 10 dagarna p.i. men saknade märkbara neurologiska tecken, vilket står i kontrast till tidigare rapporterade resultat (23). Vävnadsprover från näsborrar, lungor, luftstrupe, hjärna, lever, mjälte, njurar, hjärta, bukspottkörtel och ryggmärg skördades och homogeniserades till en 10-procentig suspension med fosfatbuffrad saltlösning. Virustitern i varje vävnad bestämdes med hjälp av plackanalyser. Virusen replikerade huvudsakligen i näsborrarna, med virustitrar som nådde 105-106 PFU/gram vävnad efter 3-6 dagar p.i. (tabell 1). Hjärnvävnad från HK483- eller HK486-infekterade illrar konserverades i 10 % neutralt buffrat formalin och behandlades för inbäddning i paraffin. De paraffininbäddade vävnaderna skars upp i 5 mm tjocka skivor och färgades med hematoxylin och eosin (H&E). Ytterligare snitt beskars för immunohistologisk färgning med kaninpolyklonala antikroppar mot ett H5-influensavirus. Histologisk undersökning visade på neuronal invasion eller skada, inklusive inflammation i plexus choroidus (tabell 2). Illrar som infekterats med HK486-viruset visade tecken på icke-suppurativ inflammation (fig. 1a) och virusantigenuttryck (fig. 1b) som varade i 12 dagar; virusantigen påvisades inte vid 1 månad p.i. Den icke-suppurativa hjärninflammationen varade i 3 månader (fig. 1c), med kvarvarande glial ärrbildning som syntes vid 6 och 9 månader p.i. i de områden där virusantigen påvisades i den tidigare fasen (fig. 1d). Vidare uppvisade illrar som infekterats med HK486 makroskopiska skador på luktsystemet vid dag 12 p.i. (fig. 1e och f). Dessa fynd tyder på att även om högpatogena H5N1-virus främst påverkar värdens luftvägar (1) kan de också ge neurologiska komplikationer. I motsats till HK486-viruset, som invaderade hjärnparenkymet hos illrar och orsakade allvarliga parenkymskador, orsakade den andra H5N1-stammen, HK483, allvarlig icke-suppurativ vaskulit utan uppenbara parenkymskador i hjärnan hos illrar vid 6 dagar p.i. Även om virusantigen inte kunde påvisas i kärlsystemet var kärlskador uppenbara, vilket kännetecknades av endotelsvullnad (fig. 2a, pilspetsar), spridda apoptotiska celler (fig. 2b, pilspetsar) och intramural infiltration av makrofager (fig. 2a, pilar) och polymorfonukleära leukocyter (fig. 2b, pil). Vaskulära lesioner fanns vid thalamus, vid gränsen mellan grå och vit substans och vid hjärnstammen. Hjärnprover som undersöktes vid 1 och 6 månader p.i. uppvisade hemorragiska lesioner som tyder på kronisk och upprepad perivaskulär blödning (fig. 2c) i thalamus, cerebellum och subarachnoidalrummet i främre hjärnan (fig. 2d). Dessa observationer stämmer överens med rapporter om influensavirusinducerade hemorragiska hjärnkomplikationer under årliga epidemier (11). Hjärnvaskulit sekundärt till virusinfektion är relativt vanligt (17) och är sannolikt orsaken till kärlväggens bräcklighet, vilket leder till hjärnblödning. Det verkar därför rimligt att dra slutsatsen att H5N1-virusinfektion hos människor kan orsaka hjärnblödning liknande den som ses vid infektion med andra neurotropa virus.
- Se inline
- Se popup
Virusåtervinning från vävnader från illrar som infekterats med HK483 eller HK486 H5N1-virus
- Se inline
- Visa popup
Prevalens av hjärnskador hos illrar vid olika tidpunkter efter infektion med högpatogena H5N1-influensavirusa
Hjärnskador hos HK486-virusinfekterade illrar. (a) Svår icke-suppurativ encefalit i det olfaktoriska området vid dag 6 efter infektion (p.i.). (b) Viralt antigenuttryck i en hjärnskada vid dag 12 p.i. Neuronala och gliaceller är färgade med anti-H5-virusantiserum. (Insats) Icke-infekterade neuroner och glia. (c) Smältande encefalit i hjärnvävnad vid 3 månader p.i. (d) Perivaskulär glial ärrbildning vid 9 månader p.i. (e) Makroskopiskt synlig hjärnlesion i en del av luktsystemet (piriform lob) vid dag 12 p.i. (f) Partiell förlust av en luktbulb (övre delen av hjärnan ) på grund av viral encefalit vid 1 månad p.i. Jämför dessa bilder med hjärnan från en åldersmatchad kontroll (nedre delen av hjärnan).
Hjärnskador hos HK483-virusinfekterade illrar. (a) Framträdande icke-suppurativ vaskulit vid dag 6 p.i. Notera den kraftiga svullnaden av en vaskulär endotelcell (pilspetsar) och migrationen av makrofager in i kärlväggen (pilar), jämfört med det normala utseendet hos den omgivande hjärnparenkymet. (b) Spridda apoptotiska celler (pilspetsar) och polymorfonukleära leukocyter (pil) i kärlväggen dag 6 p.i. (c) Gamla och färska hemorragiska lesioner i thalamus hos en iller som genomgick nekropsi vid 6 månader p.i. (pilspetsar, hemosiderinladdade makrofager i en gammal lesion; pilar, färsk hemorragi med röda blodkroppar). (d) Ny subarachnoidalblödning i en illerhjärna vid 6 månaders ålder. Observera ansamlingen av röda blodkroppar mellan leptomeninges (streckad svart linje) och arachnoid mater (streckad röd linje).
För att undersöka på vilket sätt H5N1-virus invaderar hjärnan hos illrar analyserade vi fördelningen av hjärnskador och det virala antigenuttrycket som observerats hos illrar som infekterats med HK483-, HK486-, A/Hong Kong/213/2003 (HK213), A/Vietnam/1204/2004 (VN1204) och A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004 (NCVD18)-virus. HK213-, VN1204- och NCVD18-virus förökades i MDCK-celler i minimalt essentiellt medium kompletterat med 0,3 % bovint serumalbumin. Sex månader gamla illrar inokulerades intranasalt med 106 PFU virus. Hjärnvävnader samlades in i den akuta fasen, 3 och 6 dagar efter infektionen för VN1204 och NCVD18 och dessutom 12 dagar efter infektionen för HK213. Vävnaderna behandlades för H&E-färgning och immunohistokemi för histologisk undersökning. De hjärnparenkymskador som producerades av VN1204, NCVD18 och HK213 kännetecknades av icke-suppurativ encefalit, och uttrycksmönstret för virala antigener var i stort sett detsamma som för HK486 (data visas inte). För att förstå den tredimensionella (3D) fördelningen av hjärnlesionerna och virusantigenerna plottade vi dem med hjälp av 3D-avbildning (TRI/3D-SRF2; Ratoc System Engineering Co., Ltd., Japan) av en hjärna från en gul mungo (Cynictis penicillata), vars arkitektur är nära besläktad med den som finns i illerhjärnan (20). För att visualisera luktbanan (dvs. den sensoriska banan för luktsinnet) markerade vi nervbanorna från luktbulben till den piriforma cortexen på 3D-bilderna som en referensram (fig. 3a, gul; se även Movie S1 i tilläggsmaterialet). Vi fann tre olika mönster av hjärnskador, med och utan virusantigen, orsakade av de olika H5N1-influensavirusen: de som fördelades endast längs luktbanan (fig. 3b och c, streckad gul linje; se även filmerna S2 och S3) (HK213 och NCVD18), de som upptäcktes längs luktbanan (fig. 3b och c, streckad gul linje; se även filmerna S2 och S3) (HK213 och NCVD18), de som upptäcktes längs luktbanan (fig. 3b och c, streckad gul linje; se även filmerna S2 och S3). 3d och e, streckad gul linje; se även filmerna S4 och S5) och i hjärnstammen (fig. 3d och e, vita pilar; se även filmerna S4 och S5) (HK486 och VN1204); och de som finns i andra områden (fig. 3f; se även film S6) (HK483). Grunden för att skilja den tredje gruppen av lesioner från de andra två grupperna är tydligare när lesionernas fördelning granskas bakifrån (fig. 3g och h, gult kontra blått kontra rött). Dessa kartläggningsresultat visar att de flesta av de H5N1-stammar som vi testade invaderade hjärnan via luktvägen (fig. 3, streckad gul linje). Ett undantag var HK483-stammen (fig. 3f), som tydligt riktade in sig på hjärnans kärlsystem hos illrar och som gav upphov till skador utanför luktsystemet.
Fördelning av hjärnskador efter infektion med HK483-, HK486-, HK213-, NCVD18- eller VN1204-stammen av H5N1-virus. Hjärnskador är kartlagda på tredimensionella bilder av en gul mungohjärna. Utvalda delar av hjärnsektionerna analyserades; därför är kartorna över skadornas placering diskontinuerliga. (a) Olfaktorisk väg (gul). Fördelningen av lesioner och virusantigen (rött) i samband med HK213- (b) eller NCVD18-infektion (c) följer den olfaktoriska vägen (streckad gul linje). Hos djur som infekterats med HK486 (d) eller VN1204 (e) är lesionerna och virusantigenerna lokaliserade i hjärnstammen (vita pilar) och den olfaktoriska vägen (röda tomter inom den streckade gula linjen). HK483-stammen (f) orsakade allvarliga skador på blodkärlen, med uppenbara hemorragiska lesioner (blå tomter). (g) Bakre vy av luktvägen (gula tomter). (h) Bakre vy av HK483-inducerade hemorragiska lesioner (blå) och vaskulit (röd) utanför luktvägen. Panelerna a-f är ventrala vyer.
För att H5N1-virus ska kunna bli pandemiska måste de troligen skaffa sig förmågan att växa bra i den övre delen av människans luftvägar, vilket skulle leda till effektiv överföring från människa till människa via nysningar och hosta (13, 22). Våra data från illrar tyder på att om högpatogena H5N1-virus får detta fotfäste hos människor kan de orsaka subkliniska neurologiska komplikationer genom att invadera hjärnan via nervbanorna eller genom att orsaka vaskulit i hjärnan. Tidigare har ett H3N2-virus påvisats i illerhjärnor, men mängden virus i hjärnorna var låg (mindre än 102,2 log10 50-procentiga ägginfektionsdoser) och inga tecken på virusantigener i hjärnan rapporterades (23). Vi fann att det pandemiska H1N1-viruset från 2009 replikerade effektivare i luftvägarna hos illrar än vad ett säsongsmässigt H1N1-virus från människor gjorde (9, 13, 15) och att det orsakade icke-suppurativa lesioner i luktbulben; vi hittade dock inte virus i hjärnparenkymet hos dessa djur (data visas inte). Därför är invasion av hjärnparenkym, som påvisas av förekomsten av virusantigen, ett kännetecken för H5N1-virus. Det skulle därför vara relevant att utföra retrospektiva och prospektiva studier om subkliniska neurologiska komplikationer hos H5N1-virusinfekterade patienter. Våra resultat ger anledning till oro för att subkliniska neurologiska komplikationer skulle kunna följa med allvarliga luftvägsinfektioner vid den globala spridningen av H5N1-virus.