Sanes och Lichtman använde pronukleär injektion för att föra in dessa Brainbow-konstruktioner i möss. När de avbildade mushjärnorna fann de många fler än 3-4 färger på grund av tandemintegrationen av flera kopior av konstruktionen (cirka 8 i Brainbow-1.0-möss.) Den kombinatoriska effekten av flera oberoende rekombinationshändelser leder till en regnbåge av färger. Med tre kopior av konstruktionen kan man förvänta sig tio färger (se tabellen till höger). I olika rapporter har Sanes och Lichtman observerat 90-160 olika färger på grund av ett högre antal kopior. Namnet Brainbow är verkligen passande för denna färgstarka teknik.
Optimering av systemet: Brainbow-3
Och även om Brainbow försåg neurovetenskapsmännen med den stora mängd färger som behövdes för att markera enskilda neuroner, led systemet också av ett antal begränsningar. För det första var avbildningen av Brainbow-musvävnad en utmaning på grund av den låga fluorescensintensiteten, som delvis berodde på fluorofors fotoinstabilitet, samt fluorofors tendens att aggregera i neuronernas somata. För det andra möjliggjorde systemet inte analys genom immunfärgning. Även om de fluorophorer som används är fluorescerande olika, är deras proteinsekvenser mycket homologa, vilket förhindrar utformning av antikroppar som är specifika för varje fluorofor. För det tredje innehöll Brainbow-1 och Brainbow-2 var och en ett ”standardtillstånd”, till exempel uttrycker Brainbow-1.0 RFP när konstruktionen inte har genomgått rekombination. Detta standardtillstånd uttrycktes oproportionerligt av en majoritet av neuronerna, vilket begränsade antalet distinkta färger som kunde observeras i ett givet område.
2013 släppte Dawen Cai, et al. en förfining av Brainbow-tekniken, Brainbow-3.0, med målet att övervinna de begränsningar som anges ovan. Först screenade de en mängd olika fluorescerande proteiner för att hitta de med idealiska egenskaper (låg aggregering, hög fotostabilitet och hög stabilitet efter fixering.) Av de sju resulterande proteinerna valde de tre med låga nivåer av både fluorescens och sekvensöverlappning (korall mOrange2, manet EGFP och havsanemon mKate2.) De lyckades sedan framgångsrikt generera skräddarsydda antikroppar mot vart och ett av dessa proteiner och bekräftade att det inte fanns någon korsreaktivitet, vilket öppnade upp dörren för immunfärgningsanalys. För att uppnå en jämn cellmärkning genererade de farnesylerade derivat av de fluorescerande proteinerna, som direkt transporteras till cellmembranen. Membrantrafikering av farnesylerade derivat möjliggör märkning av känsliga axonala och dendritiska processer som tidigare inte varit synliga med Brainbow-1 och -2.
Den allmänna strukturen i Brainbow-1.0 bibehålls i Brainbow-3.0, men med mOrange2, EGFP och mKate2 som fluorophorer; mOrange2 är standardtillståndet. Brainbow-3.1 och -3.2 uppvisar däremot inte standardfluorescens på grund av tillägget av en översättningsblockerande STOP-kassett omedelbart efter promotorn. STOP-kassetten innehåller en mutant YFP som inte fluorescerar, men som kan upptäckas genom immunfärgning. Denna funktion underlättar screening av Cre-negativa Brainbow-möss för att fastställa antalet och typen av celler i vilka konstruktionen uttrycks. Fotostabiliteten hos Brainbow-3.2 är förbättrad på grund av tillägget av ett posttranskriptionellt regulatoriskt element (WPRE) från woodchuck hepatitis virus, som vanligen används för att öka transgenproteinnivåerna.
Brainbow-varianter och tillämpningar utanför mushjärnan
Förutom att förbättra Brainbow-systemet utvecklade Sanes och Lichtman också en kompletterande Flpbow-konstruktion som funktionellt liknar Cre-baserad Brainbow, men som styrs av FLP/FRT-rekombinas. När de placeras under olika promotorer kan Brainbow och Flpbow användas för att märka olika cellpopulationer.
För att minska den djuruppfödning som krävs för att producera djur med Brainbow-transgener och Cre har Cai et al. också skapat en Autobow-konstruktion som innehåller både Cre och XFP:er. Cre-produktionen driver rekombination och XFP-selektion, följt av Cre-självexcision. Dessa konstruktioner upprätthålls stabilt i minst sex generationer.
Förutom de neuronala pThy1-Brainbow-konstruktionerna har Addgene också två Brainbow adeno-associerade virala vektorer (AAV) tillgängliga – AAV-EF1a-BbChT och AAV-EF1a-BbTagBY. Dessa konstruktioner innehåller två XFP:er vardera på grund av de storleksbegränsningar som är förknippade med AAV; saminfektion med båda konstruktionerna ger minst 8 färger. Användningen av AAV ger rumslig och tidsmässig kontroll utan behov av germina modifieringar och gör det möjligt att använda Brainbow i en mängd olika arter.
Fler varianter har skapats av andra laboratorier, inklusive R26R-Confetti som beskrivs i Hugo J. Snippert, et al. (2010) och MAGIC Marker-strategin som beskrivs i Karine Loulier, et al. (2014).
För närvarande används Brainbow-tekniken också för att studera modellorganismer som Drosophila och zebrafisk. Brainbow i Drosophila har hjälpt till att kartlägga neurala kretsar, t.ex. kopplingar mellan motoriska neuroner och den neuromuskulära korsningen. I zebrafiskar har metoden blivit mycket användbar vid spårning av stamtavlor; ”Zebrabow” användes för att spåra utvecklingen av hornhinnans epitel.
För forskare som är intresserade av neurovetenskap och utveckling är Brainbow ett värdefullt verktyg för att markera och följa enskilda celler på grund av det breda utbudet och den höga stabiliteten hos färgerna. Sanes och Lichtman uppskattar att Brainbows färgglada märkning har minskat kartläggningstiden för ett givet avsnitt av hjärnan med minst en storleksordning. Det är uppenbart att ytterligare förfiningar av Brainbow-tekniken kommer att ge viktiga insikter om hjärnans och andra biologiska systems komplicerade fysiska organisation.
Intresserad av att tillämpa Brainbow i din forskning? Kolla in Brainbow plasmider som finns tillgängliga från Addgene!
Finn Brainbow plasmider @Addgene:
- Brainbow 1.0, 1.1, 2.1 plasmider
- Brainbow 3.0, 3.1, 3.2 plasmider
Transgena strategier för kombinatoriskt uttryck av fluorescerande proteiner i nervsystemet. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62. PubMed.
En teknikfärgad strategi för connectomen. Lichtman JW, Livet J, Sanes JR. Nature Reviews Neuroscience. 2008 Jun;9(6):417-22. doi: 10.1038/nrn2391. Epub 2008 Apr 30. PubMed.
Intestinal kryptohomeostas beror på neutral konkurrens mellan symmetriskt delande Lgr5-stamceller. Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H. Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. PubMed.
Drosophila Brainbow: en rekombinasbaserad fluorescensmärkningsteknik för att dela upp neurala uttrycksmönster. Hampel S, Chung P, McKellar CE, Hall D, Looger LL, Simpson JH. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):253-9. doi: 10.1038/nmeth.1566. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Flybow: genetisk multicolor cellmärkning för analys av neurala kretsar i Drosophila melanogaster. Hadjieconomou D, Rotkopf S, Alexandre C, Bell DM, Dickson BJ, Salecker I. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):260-6. doi: 10.1038/nmeth.1567. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Förbättrade verktyg för Brainbow-verktygslådan. Cai D, Cohen KB, Luo T, Lichtman JW, Sanes JR. Nature Methods. 2013 May 5:10(6):540-7. doi: 10.1038/nmeth.2450. Epub 2013 May 5. PubMed.
Zebrabow: multispektral cellmärkning för cellspårning och linjeanalys i zebrafiskar. Pan YA, Freundlich T, Weissman TA, Schoppik D, Wang XC, Zimmerman S, Ciruna B, Sanes JR, Luchtman JW, Schier AF. Utveckling. 2013 Jul;140(13):2835-46. doi: 10.1242/dev.094631. PubMed.
Multiplex cell- och linjespårning med kombinatoriska etiketter. Loulier K, Barry R, Mahou P, Le Franc Y, Supatto W, Matho KS, Ieng S, Fouquet S, Dupin E, Benosman R, Chédotal A, Beaurepaire E, Morin X, Livet J. Neuron. 2014 Feb 5;81(3):505-20. PubMed.
.