Vill du börja använda blodprover i din translationella forskning? Kanske är du intresserad av metastatisk bröstcancer eller icke-småcellig lungcancer. Eller kanske har utmaningarna och begränsningarna med fasta tumörprover fått dig att tänka… det är dags.
Nu vad?
Låt oss titta närmare på DNA-utbytet och verkligheten när det gäller att arbeta med cellfritt DNA från plasma. Med cellfritt DNA (eller cfDNA) avses allt icke inkapslat DNA i blodet. En del av detta cellfria DNA härstammar från en tumörklon och kallas cirkulerande tumör-DNA (eller ctDNA). cfDNA är nukleinsyrafragment som kommer in i blodomloppet under apoptos eller nekros. Normalt rensas dessa fragment upp av makrofager, men vi tror att överproduktionen av celler i cancer lämnar mer cfDNA kvar. Dessa fragment är i genomsnitt cirka 170 baser långa, har en halveringstid på cirka två timmar och finns i både tidiga och sena sjukdomsstadier i många vanliga tumörer, inklusive icke-småcellig lunga och bröst. Med detta sagt varierar cfDNA-koncentrationen kraftigt och förekommer med mellan 1 och 100 000 fragment per milliliter plasma.
Om du har varit med om nästa generations sekvensering ett tag kanske du vill veta vad känslighet och specificitet är. Vi visade hög känslighet och specificitet för varianter med en frekvens större än punkt en procent med 20 nanogram input-DNA och större än punkt fem procent med 5 nanogram . Om du vill veta mer om hur man gör detta kan du titta på vår video om cfDNA-analyser. Du kanske har hört talas om användning av cfDNA för analyser vid punkt noll en procents detektionsgräns. Även om tekniken finns för att nå 0,01 procent (digital droplet till exempel) finns det en biologisk gräns som vi måste prata om.
Från ett 10 mL blodprov, med hjälp av Applied Biosystems MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit, erhåller vi rutinmässigt cirka 20 nanogram cfDNA, eller cirka 6 användbara molekyler för analys. En snabb beräkning visar att vi kan förvänta oss cirka 25 molekyler vid 1 % av detektionsgränsen. Vid 0,1 % förväntas endast 2-3 molekyler. Det innebär att det under 0,1 % kanske inte finns några molekyler för analys. Kom också ihåg att cfDNA-koncentrationerna är mycket varierande. De kan vara mycket låga i kritiska skeden, t.ex. vid tidiga återfall eller utveckling av resistens, som många forskare nu fokuserar på. För att framgångsrikt isolera 20 nanogram DNA från blodplasma finns både manuella och automatiserade metoder tillgängliga beroende på dina behov av genomströmning.
DNA i handen, din forskning dikterar vilken väg du ska ta i nuläget. Du kanske väljer digital PCR för studier om övervakning av återfall. För forskning om val av terapi kan en nästa generations sekvenseringsanalys vara att föredra. Oavsett vart din forskning om flytande biopsi tar dig kan vi hjälpa dig att nå dit med kompletta lösningar för cfDNA-analys, från bara några få mål till analyser med flera gener.
Jag hoppas att vi har gett dig några saker att tänka på när du överväger att använda cellfritt DNA i ditt labb. Men jag är säker på att du kommer att ha några frågor. Så skicka in dina frågor på thermofisher.com/ask och prenumerera på vår kanal för att se fler videor som denna. Och kom ihåg, när du är osäker, bara Seq It Out!