Maj 12, 2018
En vanlig fråga som forskare alltid ställer när de får en signal från en antikroppsbaserad analys är: ”
Antikroppsspecificitet är alltid ett problem för forskare. Även om det finns ett antal valideringsmetoder som har använts för testning av specificitet, övertolkas uppgifterna ofta. Forskningsdata från olika grupper har visat att vissa ofta använda monoklonala antikroppar på marknaden faktiskt inte är monospecifika. De kan korsreagera med andra proteiner och korsreaktiviteten kan vilseleda forskare med falskt positiva resultat och eventuellt orsaka oväntade bieffekter och falska diagnostiska rapporter för kliniker.
Vilka kontroller bör vi använda för validering av antikroppsspecificitet?
Cellinjer och vävnader som uttrycker målproteinerna i stora mängder kan användas som positiva kontroller för antikroppsvalidering.Det kan vara endogena proteiner eller överuttryckta proteiner som kodas av en cDNA-klon. Positivkontrollen kommer dock inte att kunna bekräfta antikroppens specificitet. Du kan se ett band med rätt storlek eller en positiv färgning på rätt subcellulär plats, men allt detta kan vara falska positiva signaler från antikroppens korsreaktivitet. För antikroppsvalidering krävs därför normalt en negativ kontroll för bedömning av ospecifik bindning.
Knockout-validering är hittills den bästa negativa kontrollen för bedömning av antikroppsspecificitet. Vid knockoutvalidering testas antikroppen på en knockout-cellinje som inte uttrycker målproteinet. Från och med 2017 har OriGene samarbetat med EdiGene, en CRISPR-innovatör, för att producera dubbelknockout-celler på ett höggenomsnittligt sätt. Till skillnad från knockout-cellinjen från Horizon är OriGenes knockout-cellinjer från de vanligaste cellinjerna, såsom HEK293T eller HeLa, vilket gör produkten mer relevant för forskare.I denna dubbla knockout-cellinje finns inte antikroppens måltavla eftersom genen som kodar för proteinet elimineras eller ”knockas ut”. Prover från knockout-celler och föräldraceller (vildtyp) testas sida vid sida mot samma antikropp, och om antikroppen verkligen är specifik bör den endast detektera den specifika signalen i vildtyp-cellen men inte i knockout-cellinjen. Med hjälp av lysaten från dessa knockoutceller har vi validerat mer än 100 monoklonala antikroppar (KO-validerade antikroppar). Knockoutvalidering anses erbjuda en sann negativ kontroll för testning av antikroppsspecificitet.
Men är knockoutvalidering tillräckligt för att bekräfta en antikropps monospecificitet? Jag skulle vara försiktig med denna slutsats.För det första är effekterna av knockout-celler utanför måltavlan inte särskilt väl studerade i detta skede. Det kan alltså hända att en knockoutcell inte bara eliminerar uttrycket av det aktuella proteinet utan också eliminerar eller minskar uttrycket av ett annat protein, som kan vara ett protein som korsreagerar med antikroppen. Den negativa signalen betyder alltså inte alltid att antikroppen inte kommer att reagera med andra proteiner än det intressanta proteinet. För det andra är testning med knockoutceller/vävnader endast möjlig för icke väsentliga proteiner. För de essentiella proteinerna är knockout omöjligt. För dessa proteiner behöver du alltså ett annat sätt att testa antikroppens specificitet.
För några år sedan utvecklade OriGene en proteinmatrismetod för testning av antikroppsspecificitet. Med världens största samling av överexpressionslysat har vi tillverkat ett unikt proteinchip som innehåller >10k överexpressade humana proteiner i två exemplar på ett enda nitrocellulosebelagt glasobjektsglas. Denna proteinmikroarrayteknik har använts för att validera specificiteten hos många OriGeneUltraMAB™ monoklonala antikroppar. Genom att öka antalet proteiner på chipet kan korsreaktiviteten hos en antikropp studeras ytterligare över hela den mänskliga proteasomen.
Sammanfattningsvis är testning av antikroppsspecificitet ganska komplicerat. Den måste valideras med hjälp av flera olika verktyg och riktningar. i takt med att tekniken fortsätter att utvecklas kommer vi att få fler värdefulla tillgångar och standardiserade förfaranden för validering av antikroppar. forskarna kommer inte att ställas inför samma fråga när de får positiva signaler från sina antikroppsbaserade analyser.