Variationer i Calvin-Benson-cykeln: urvalstryck och optimering?

Calvin-Benson-cykeln är grunden för kolfixering i alla fotosyntetiska organismer. Man vet dock relativt lite om i vilken utsträckning dess funktion varierar mellan olika arter. Med hjälp av en metod för metabolitprofilering upptäcktes skillnader i nivåerna av viktiga intermediärer i Calvin-Benson-cykeln bland C3- och C4-arter. Dessa skillnader i metabolitpooler observerades mellan C3-arter samt mellan C3- och C4-växter. Detta arbete ger upphov till den intressanta möjligheten att olika selektionstryck på komponenterna i Calvin-Benson-cykeln har lett till en oberoende optimering av den mellan arter.

1954 publicerade Melvin Calvin, Andrew Benson och James Bassham den metaboliska väg som används för att fixera koldioxid i atmosfären – Calvin-Benson-cykeln (Bassham et al., 1954). Deras grundläggande upptäckter baserades på att de utfodrade algen Chlorella med 14C-märkt koldioxid och spårade märkningen av metaboliter över tiden (Bassham et al., 1954; Sharkey 2018). De upptäckte att cykeln består av tre faser: Först fixerar enzymet ribulos-1,5-bisfosfatkarboxylas/oxygenas (Rubisco) CO2 med hjälp av ribulos-1,5-bisfosfat (RuBP) som acceptör, vilket producerar två 3-kols molekyler, 3-fosfoglycerat (3-PGA). För det andra används ATP och NADPH som genereras under den fotosyntetiska elektrontransportkedjan (fotosyntesens ljusberoende reaktioner) för att fosforylera och därefter reducera 3-PGA till triosfosfat (trios-P). För det tredje regenereras koldioxidacceptorn RuBP genom en rad reaktioner (ruta 1). Majoriteten av de enzymer som deltar i denna cykel upptäcktes tidigare eller kort därefter (Horecker et al. 1951; Racker et al. 1953; Mayoudan et al. 1957). Sedan dess har man i allmänhet antagit att Calvin-Benson-cykelns funktion är mycket konserverad bland olika växtarter.

Ruta 1.

Calvin-Benson-cykeln

Calvin-Benson-cykeln består av tre faser: (1) kolfixering, (2) reduktion och (3) regenerering av CO2-acceptorn.

Karboxylering sker via ribulos-1,5-bisfosfatkarboxylas/oxygenas (Rubisco), som fixerar CO2 med hjälp av ribulos-1,5-bisfosfat (RuBP) som acceptor och på så sätt producerar två molekyler med 3 kol av 3-fosfoglycerat (3-PGA). 3-PGA fosforyleras därefter av fosfoglyceratkinas (PGK) och reduceras till triosfosfat (trios-P) av glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) i reduktionsfasen. Cykeln använder 3 ATP och 2 NADPH per molekyl fixerad koldioxid. Triose-P kan transporteras ut ur kloroplasten för att producera sackaros i cytosolen. Fruktos 1,6-bisfosfat aldolas (FBP ald) kan omvandla trios-P till fruktos-6-fosfat (F6P), den mellanprodukt som används för att producera stärkelse. Triose-P kan också omvandlas till RuBP i en serie regenerationsreaktioner för att binda fler koldioxidmolekyler.

Abkortningar: Förkortningar: Fruktos-1,6-bisfosfat (FBP), fruktos-1,6-bisfosfatas (FBPas), erytros-4-fosfat (E4P), sedoheptulos-1,7-bisfosfat aldolas (SBP ald), sedoheptulos-1,7-bisfosfat (SBP), sedoheptulos-1,7-bisfosfatas (SBP), sedoheptulos-1,7-bisfosfatas (SBPas), sedoheptulos-7-fosfat (S7P), transketolas (TK), ribose-5-fosfat (R5P), xylulos-5-fosfat (Xu5P), ribose-5-fosfat isomeras (RPI), ribulos-5-fosfat epimeras (RPE), ribulos-5-fosfat (Ru5P), fosforibulokinas (PRK). Enzymer som katalyserar irreversibla reaktioner är markerade med en kraftig fet pil (dvs. Rubisco, FBPase, SBPase och PRK).

I den stora majoriteten av landväxter utförs Calvin-Benson-cykeln, tillsammans med fotosyntesens ljusberoende reaktioner, huvudsakligen i bladens mesofyllceller. Rubisco diskriminerar dock dåligt mellan CO2 och O2 (Bowes et al., 1971) och fixering av en O2-molekyl i stället för CO2 resulterar i fotorespiration – en energetiskt dyr räddningsväg för att återvinna RuBP. Efter att den atmosfäriska CO2-koncentrationen sjönk dramatiskt för 2,3 miljarder år sedan (Bekker et al., 2004) utvecklades två kolkoncentreringsmekanismer som begränsar mängden fotorespiration. Dessa modifieringar av den grundläggande fotosyntesprocessen, C4-fotosyntes och Crassulacean Acid Metabolism (CAM), uppstod var och en flera gånger (Sage et al., 2011). C4-fotosyntes innebär en rumslig separation av fotosyntesen så att komponenterna i både de ljusberoende reaktionerna och Calvin-Benson-cykeln sker i mesofyll- och buntskiktsceller (ruta 2). Trots skillnaderna i den anatomiska placeringen av kolfixeringen har man hittills vetat lite om hur Calvin-Benson-cykelns funktion kan skilja sig åt i C4- jämfört med C3-växter och även mellan C3-växter.

Ruta 2.

Kolkoncentreringsmekanismen i C4-växter

I 1966 upptäckte Hal Hatch och Roger Slack C4-fotosyntesen (Hatch och Slack, 1966), som innebär en kolkoncentreringsmekanism som läggs till på den ordinarie C3-fixeringsvägen för kol. De använde 14C-märkning för att visa att koldioxid i sockerrörsblad först fixerades till en 4-kolsyra, snarare än 3-fosfoglycerat (3-PGA) som i C3-växter. C4-växter använder fosfenolpyruvatkarboxylas (PEPC) som första kolfixeringsenzym i mesofyllcellerna. Den 4-kolsyra (malat eller aspartat beroende på typ av C4-fotosyntes) som produceras i mesofyllcellerna går sedan in i buntskiktets sköldceller, där den dekarboxyleras och koldioxid frigörs. Denna mekanism för kolkoncentration gör att Rubisco nästan uteslutande kan fungera som karboxylas under Calvin-Benson-cykeln i buntskivecellerna. Förutom en omkonfigurering av befintliga metaboliska enzymer kräver C4-vägen utveckling av en specialiserad bladanatomi (Kranz-anatomi) som inkluderar en ökning av venavståndet och storleken på buntskidcellerna. Klassiskt sett har tre olika typer av C4-fotosyntes erkänts, uppkallade efter det primära enzym som ansvarar för dekarboxyleringsreaktionen i buntskivecellerna: NAD-ME, NADP-ME eller PEPCK-typ. Förkortningar: kolsyreanhydras (CA), oxaloacetat (OA), NADP-beroende malatdehydrogenas (NADP-MDH), malat (M), NADP-beroende malicenzym (NADP-ME), pyruvat (Pyr), pyruvat, ortofosfatdikinas (PPDK), fosfenolpyruvat (PEP).

Variation i metaboliter i Calvin-Benson-cykeln mellan arter

Calvin-Benson-cykeln är utan tvekan en av de mest kritiska biokemiska vägarna på jorden, eftersom den är den väg som används för assimilering av kol i växter – hjärtat av fotosyntesen. Men kör alla växtarter denna väg på samma sätt? Arrivault et al. (2019) profilerade förekomsten av metaboliter i Calvin-Benson-cykeln från fem C3-växter (inklusive Arabidopsis och flera viktiga grödor som ris, vete och kassava) och fyra C4-växter (inklusive majs). Totala metaboliter extraherades från mogna blad och mättes med hjälp av vätskekromatografi i omvänd fas kopplad till tandem masspektrometri (LC-MS/MS). För tillförlitlig kvantifiering spikades proverna med isotopmärkta interna metabolitstandarder. 3-PGA kvantifierades enzymatiskt. Metabolitprofilerna för de olika växtarterna jämfördes med hjälp av huvudkomponentanalys.

Skrikande nog upptäckte Arrivault et al. (2019) betydande skillnader i metabolitprofilerna för intermediärer i Calvin-Benson-cykeln bland de fem C3-arter som de studerade. Intermediärer som varierade mest var bland annat de absoluta nivåerna av 3-PGA, trios-P, ribulos-5-fosfat (Ru5P) och xylulos-5-fosfat (Xu5P). De relativa nivåerna av RuBP jämfört med nivåerna av intermediärer som är involverade i RuBP-regenerering varierade mellan arterna. Författarna påvisade dessutom variabilitet i de relativa nivåerna av metabolitpar som fruktos-1,6-bisfosfat (FBP) och fruktos-6-fosfat (F6P), som är sammankopplade via FBPasets irreversibla reaktion, och i metabolitparet sedoheptulos-1,7-bisfosfat (SBP) och sedoheptulos-7-fosfat (S7P), som irreversibelt interkonverteras av SBPaset. I de flesta fall skiljde sig de fem C3-arterna tydligt från varandra i huvudkomponentanalysen. I vilken utsträckning de skiljde sig åt berodde på om data normaliserades till färskvikt, klorofyllhalt eller proteinhalt. Variationen i dessa intermediärer inom de fem C3-arterna pekar på skillnader i hur växterna kör samma kolfixeringsväg. Denna information har konsekvenser för strategier som syftar till att förbättra fotosyntesen. Till exempel kan SBPase begränsa fotosyntesens hastighet (Zhu et al., 2007) och överuttryck kan öka fotosyntesens effektivitet (Lefebvre et al., 2005; Feng et al. 2007; Ding et al., 2016; Driever et al., 2017). Att ändra aktiviteten hos ett enda enzym i Calvin-Benson-cykeln kan alltså påverka fotosyntesens hastighet och därefter biomassa och avkastning. Det är dock känt att effektiviteten av detta tillvägagångssätt varierar mellan olika arter. Den redan existerande variationen i nivåerna av metaboliterna SBP och S7P mellan C3-arter som rapporterades av Arrivault et al. (2019) är därför viktig och kan ge en inblick i fotosyntesens varierande svar på att öka mängden SBPase.

Med tanke på att kolkoncentrationsmekanismen hos C4-växter begränsar fotorespirationen var det kanske mindre förvånande att den första produkten av fotorespirationen, 2-fosfoglykolat (2-PG), var mindre rikligt förekommande hos C4-arter än hos C3-arter. Dessutom hade C4-plantor lägre nivåer av RuBP än C3-plantor, vilket stämmer överens med deras lägre investering i Rubisco. Även när 2-PG- och RuBP-nivåerna utelämnades från datasetet separerades dock nästan alltid C3- och C4-metabolitnivåerna i huvudkomponentanalysen. Dessa skillnader var konsekventa, oavsett om data normaliserades till färskvikt, klorofyllhalt eller proteinhalt, och förändringarna tyder alltså på att de enzymer som ansvarar för att generera metaboliterna genomför katalysen med olika hastighet i olika arter. Författarna myntar termen ”operation mode” för Calvin-Benson-cykeln för att beskriva dessa skillnader – så att cykeln fungerar på olika sätt mellan olika arter även om samma enzymer är inblandade, vilket leder till de observerade förändringarna i de relativa nivåerna av intermediärer. De föreslår därför att skillnaderna i Calvin-Benson-cykeln mellan C3- och C4-växter är bredare än en enkel rumslig förflyttning till buntskiktets celler i de senare, och att de inbegriper en anpassning av cykelns driftssätt.

Framtidsperspektiv

Det är intressant att fastställa att Calvin-Benson-cykelns driftssätt kan variera, särskilt med tanke på att strukturen på vägen (när det gäller de inblandade enzymerna och deras reaktionssekvens inom cykeln) har varit mycket bevarad. Under de miljontals år som gått sedan cykelns första uppkomst har dock förhållandet mellan O2 och CO2 i atmosfären förändrats dramatiskt. Dessa förändringar tros ha bidragit till att vissa växtarter har utvecklat mekanismer för kolkoncentration. Författarna föreslår nu att låga CO2-nivåer i kombination med specifika miljöförhållanden kan ha lett till utvecklingen av olika driftsformer för Calvin-Benson-cykeln. Den observerade variationen i metabolitprofiler kan således återspegla olika selektionstryck på hur Calvin-Benson-cykeln regleras i olika växtlinjer. Den metod som författarna använde för att analysera intermediärer i Calvin-Benson-cykeln skulle nu kunna tillämpas på fler arter, och det skulle vara särskilt intressant om dessa omfattade ett bredare spektrum av växtfamiljer i olika miljöer. Detta skulle kunna avslöja om variationen strikt följer fylogenetiska taxa eller specifika miljöer som växterna har anpassat sig till.

Det är också så att de C4-växter som analyserades i Arrivault et al. alla utför NADP-ME-typen av C4-fotosyntes. En lovande linje för ytterligare studier skulle därför vara att undersöka om liknande förändringar i Calvin-Benson-cykelintermediärer observeras i alla tre typer av C4-metabolism, eller om de är specifika för NADP-ME-typen.

Detta arbete är en utmärkt utgångspunkt för att upptäcka hur dessa olika Calvin-Benson-cykelmodeller styrs på molekylär nivå. Metabolitprofilering möjliggör en opartisk metod för att bedöma variationen i nivåerna av intermediärer mellan olika arter, men de underliggande orsakerna till dessa skillnader återstår att fastställa. Variationen mellan arter kan bero på skillnader i genuttryck och efterföljande proteinaktiviteter, variation i aminosyrasekvensen som påverkar kinetiken eller posttranslationell reglering av enzymerna. Noterbart är att nästan alla enzymer i Calvin-Benson-cykeln är föremål för åtminstone någon form av redoxreglering, mestadels via thioredoxin (TRX)/ferredoxin (Fd)-systemet (Buchanan och Palmer, 2005; Michelet et al. 2013). Integrationen av dessa uppgifter om transkript, proteinabundans och enzymaktivitet till metabolitnivåerna kan avslöja den molekylära grunden för variationen. Dessutom kan de observerade variationerna i metabolitpooler också vara relaterade till krav på vissa intermediärer, särskilt de som dras tillbaka från Calvin-Benson-cykeln. Till exempel kan flödet genom cykeln påverkas av utträdesvägar för att möjliggöra syntesen av stärkelse (via F6P), sackaros och isoprenoider (via trios-P), aminosyror via shikimatvägen (via E4P) samt tiamin och nukleotider (via R5P) (Raines, 2011).

Arrivault et al. (2019) rapporterar om intressant variation i hur komponenterna i Calvin-Benson-cykeln fungerar i olika växtarter. Detta kommer säkerligen att katalysera ytterligare studier om hur växter har anpassat denna grundläggande och urgamla väg för kolfixering till olika miljöer.