I recettori di adesione non solo forniscono un attacco fisico all’ECM, ma creano anche un’impalcatura di segnalazione dipendente dall’adesione che contiene una serie di proteine adattatrici e chinasi.5, 6 Così, le integrine funzionano in modo analogo ai recettori dei fattori di crescita (GFR), e attivano molte delle stesse vie a valle. Le integrine si interfacciano anche direttamente con i GFR, e permettono alle cellule di rispondere in modo ottimale alle citochine solubili solo quando sono attaccate alla ECM corretta.
La specificità per particolari tipi di ECM avviene attraverso la gamma di integrine espresse sulle cellule.6 Gli esseri umani hanno almeno 24 diverse integrine, e sebbene alcune siano espresse sulle stesse cellule e riconoscano anche gli stessi componenti ECM, molte hanno ruoli essenziali in tessuti specifici. Le cellule epiteliali mammarie aderiscono a una membrana basale ricca di laminina tramite l’integrina α6β1. Lo stroma sottostante i dotti e gli alveoli mammari contiene collagene I, che è riconosciuto da α2β1 sulle cellule mammarie. Tuttavia, anche se esprimono integrine che legano il collagene, non supportano la sopravvivenza delle cellule mammarie e alla fine vanno incontro ad apoptosi.7, 8 I melanociti sono analogamente mantenuti nel corretto compartimento del tessuto attraverso le interazioni integrina/ECM. Il derma sottostante è ricco di collagene, e questo non riesce a sostenere l’adesione e la sopravvivenza dei melanociti, poiché, a differenza delle MEC, essi non esprimono le integrine adatte. Tuttavia, durante l’invasione del melanoma attraverso il derma ricco di collagene, l’upregolazione di αvβ3 sulle cellule di melanoma permette loro di ricevere segnali antiapoptotici da un ambiente ECM normalmente ostile.9 L’inibizione della funzione αvβ3 usando anticorpi bloccanti ha indotto l’apoptosi delle cellule di melanoma.
Come fa l’adesione tramite le integrine a mantenere in vita le cellule? L’adesione mediata dalle integrine regola tutte le stesse vie di segnalazione che controllano l’apoptosi nella sopravvivenza mediata dai fattori di crescita, nelle risposte ai danni al DNA e nell’apoptosi mediata dai recettori della morte, anche se in misura diversa. Quali vie regolano l’anoikis varia a seconda del tipo di cellula, con diverse integrine che attivano cascate di segnalazione distinte (Figura 1). Per esempio, le integrine possono attivare la segnalazione della PI3-chinasi, la classica via ERK, così come le MAP chinasi attivate dallo stress come la c-Jun N-terminal kinase (Jnk).5 Queste possono essere attivate in una serie di modi specifici alle diverse integrine. Alcune integrine (α1β1, α5β1 e αvβ3) reclutano le chinasi della famiglia src Fyn e Yes attraverso un’interazione con la caveolina 1, che può poi attivare le classiche vie ERK reclutando Shc, Grb2 e Sos10 (Figura 1a). Molte integrine reclutano pp125FAK (chinasi di adesione focale), una tirosina chinasi non recettoriale che si attiva in risposta all’adesione11 (Figura 1b). Pp125FAK interagisce con una serie di molecole di segnalazione e adattatori, tra cui Src, PI3-chinasi, paxillina e p130CAS, ed è stato collegato a una serie di vie di segnalazione che controllano la migrazione, la proliferazione e l’apoptosi. La chinasi legata all’integrina è anche reclutata nei siti di adesione ed è stata implicata nella segnalazione della sopravvivenza.12, 13 Esiste una notevole sovrapposizione tra le vie a valle attivate da questi meccanismi alternativi di segnalazione dell’integrina. Metterò in evidenza alcuni esempi che illustrano la diversità nella segnalazione di anoikis.
Illustrazione schematica di alcune delle connessioni molecolari dei complessi di adesione (aderenze focali) che sono implicate nella segnalazione di sopravvivenza. L’assemblaggio dei complessi di adesione dipende non solo dalle interazioni tra le integrine e l’ECM sottostante, ma anche dalle connessioni con il citoscheletro. L’attivazione della segnalazione delle integrine è, quindi, più complessa di una semplice interazione recettore/ligando. Fare riferimento al testo principale e ai riferimenti ivi contenuti per i dettagli. (a) Le subunità α di alcune integrine possono reclutare le chinasi della famiglia Src Fyn e Yes attraverso interazioni con la caveolina, che poi attivano la via classica ERK. (b) La maggior parte delle subunità β delle integrine reclutano FAK attraverso interazioni con proteine come la talina. Talina, vinculina e altre proteine di adesione focale agiscono sia come leganti tra le integrine e il citoscheletro di actina, sia come impalcatura per il reclutamento di molecole di segnalazione come FAK e paxillina. (c) L’adesione e la segnalazione del GFR sono intimamente legate e la regolazione può avvenire a diversi livelli. L’adesione all’ECM può controllare l’espressione dei recettori GF, se possono essere attivati o meno, o se possono interagire con gli effettori a valle come le classiche vie ERK e PI3-chinasi
Pp125FAK ha dimostrato di essere necessaria per sopprimere l’anoiki in diversi tipi di cellule, sia attraverso l’espressione di forme dominanti-negative, la microiniezione di anticorpi anti-FAK o l’uso di forme dominanti attive per sopprimere la morte cellulare.14, 15, 16 FAK può regolare la segnalazione della PI3-chinasi, la segnalazione delle MAP chinasi, le piccole GTPasi e altre tirosin-chinasi come quelle della famiglia Src, che possono influenzare la sopravvivenza cellulare.11 Nelle cellule MDCK, il distacco dalla ECM può attivare Jnk, fornendo un segnale proapoptotico.17 Tuttavia, un altro studio che ha utilizzato anche cellule MDCK non ha trovato alcuna correlazione tra Jnk e anoikis.18 Invece, l’attivazione di PI3-chinasi in cellule MDCK aderenti era necessaria per sopprimere l’anoikis, simile a quella vista nelle cellule epiteliali mammarie.14 Jnk può essere sia pro- che antiapoptotico, a seconda del suo contesto cellulare. Uno studio su fibroblasti primari ha scoperto che l’attivazione di pp125FAK di Jnk nelle cellule aderenti era necessaria per sopprimere l’anoikis.19 Nei fibroblasti, l’anoikis è risultata anche dipendente da p53.20 In condizioni senza siero, FAK è necessaria per sopprimere l’apoptosi p53-dipendente. In assenza di FAK o di adesione, p53 viene attivata attraverso la fosfolipasi A2 e la protein chinasi Cγ. L’apoptosi è stata inibita dalla sovraespressione di Bcl-2 o da una forma dominante-negativa di p53, indicando che questo meccanismo p53-dipendente richiede ancora la permeabilitazione mitocondriale. Nello stesso studio, i fattori di crescita hanno fornito un forte segnale di sopravvivenza PI3-chinasi-dipendente e i fibroblasti non erano più sensibili all’inibizione di pp125FAK.
L’adesione al corretto ECM da sola non è sufficiente a fornire un segnale di sopravvivenza. La diffusione e la forma delle cellule possono influenzare profondamente il fenotipo, e il ruolo del citoscheletro in questi aspetti della segnalazione di adesione è fondamentale. Il grado di diffusione delle cellule endoteliali su substrati micropatterned ha causato un passaggio tra proliferazione, differenziazione e apoptosi, indipendentemente dal tipo di ECM e di integrina usati per l’attacco.21, 22 Allo stesso modo, le cellule epiteliali mammarie richiedono una specifica disposizione tridimensionale (3-D) per sopprimere l’apoptosi.23 Questa regolazione dell’apoptosi attraverso la disposizione delle cellule all’interno di un’architettura 3-D può contribuire alla morfogenesi della ghiandola mammaria.24 La forma delle cellule è controllata dal citoscheletro e dalle sue connessioni con le integrine nelle giunzioni cellula/MCE e cellula/cellula. I cambiamenti in queste forze meccaniche possono alterare le vie di segnalazione cellulare associate all’adesione cellulare, influenzando così la sopravvivenza.25, 26 I modi in cui le cellule percepiscono le forze meccaniche associate alla diffusione e all’architettura del tessuto, e come queste influenzano la segnalazione, sono riviste in dettaglio altrove.27, 28, 29
Un’ulteriore complicazione si presenta quando consideriamo la diafonia tra le integrine e le GFR. Molte GFR sono influenzate dall’adesione all’ECM, permettendo, per esempio, il controllo della proliferazione dipendente dall’ancoraggio.30 La segnalazione di Pp125FAK può influenzare direttamente la capacità delle GFR di controllare l’attivazione di ERK e la transizione G1-M. Non è sorprendente, quindi, che questo crosstalk possa influenzare l’anoikis (Figura 1c). Negli oligodendrociti primari, le integrine fanno crosstalk con la GFR, permettendo la sopravvivenza dipendente dal bersaglio in condizioni di limitazione dei fattori di crescita.31 A livelli fisiologici di neuregulina, l’attaccamento degli oligodendrociti appena formati alla laminina sugli assoni, attraverso α6β1, era necessario per attivare completamente i segnali di sopravvivenza. L’interazione laminina/α6β1 ha permesso alla neuregulina di attivare un forte segnale di sopravvivenza ERK dipendente. Le cellule epiteliali mostrano anche la regolazione dell’anoikis attraverso il crosstalk dell’integrina GFR. Le cellule epiteliali dipendono sia dai fattori di crescita che dall’adesione per la sopravvivenza, e l’assenza di entrambi provoca l’apoptosi. Tuttavia, non lavorano necessariamente attraverso segnali distinti. Le cellule epiteliali mammarie primarie dipendono dall’adesione alla laminina insieme al fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1).32 L’attivazione del recettore IGF-1 sopprime l’apoptosi attraverso un percorso PI3-chinasi-dipendente.33 L’adesione alla laminina sembra essere un requisito per questa segnalazione del recettore IGF. Le MEC primarie coltivate su collagene non attivano efficacemente la PI3-chinasi in risposta all’IGF-1 e vanno incontro ad apoptosi. La linea di MEC umane MCF10A mostra il requisito per la segnalazione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGF), anche se in questo caso sembra funzionare attraverso la classica via ERK.34 In assenza di adesione, le cellule MCF10A perdono rapidamente l’espressione della superficie cellulare di EGFR, portando all’upregolazione della proteina Bcl-2 Bim. Una linea cellulare di tumore al seno non ha mostrato questa downregulation di EGFR indotta dal distacco, e la sovraespressione di EGFR nelle cellule MCF10A ha inibito l’anoikis. È interessante notare che diverse linee di MEC sembrano mostrare differenze nel modo in cui le integrine si collegano ai GFR per controllare l’anoikis.35 Così, il confine tra integrine e fattori di crescita nella regolazione dell’apoptosi sembra sfocato.