4.3 Dalla vescicola del cristallino al cristallino maturo
La vescicola del cristallino si forma chiudendo la coppa del cristallino (conosciuta anche come fossa del cristallino) e staccandosi dall’ectoderma superficiale. Un passo intermedio è lo sviluppo di un peduncolo della lente che tiene insieme la vescicola chiusa e l’ectoderma superficiale per alcune ore (nel topo). La vescicola della lente è quasi sferica con una grande cavità centrale; le cellule del suo polo posteriore si allungano fino a raggiungere le cellule epiteliali anteriori e riempiono l’intera vescicola della lente; queste cellule allungate sono denominate cellule delle fibre della lente primaria. Questo passo avviene intorno al 44° giorno di gestazione negli embrioni umani e a E11,5 nel topo (Fig. 10.5). Le cellule al polo anteriore della vescicola della lente rimangono come cellule epiteliali. Le cellule mitoticamente attive che circondano la regione centrale dell’epitelio della lente si spostano nella regione equatoriale (o regione dell’arco della lente), dove si allungano e si differenziano in fibre secondarie della lente. La linea mediana, dove le fibre del cristallino secondario provenienti da punti opposti dell’equatore si uniscono, è chiamata sutura anteriore e posteriore del cristallino. Le fibre della lente secondaria formano strati concentrici intorno alle fibre primarie del nucleo della lente (nel topo al giorno E15,5; Fig. 10.5). Con questa disposizione, le fibre della lente verso la periferia sono successivamente più giovani in termini di sviluppo e differenziazione. Finché la lente cresce, nuove fibre secondarie si spostano dall’equatore sulla corteccia esterna della lente.
Figura 10.5. Formazione della lente. Una volta che la vescicola del cristallino si è formata, le fibre del cristallino primario si allungano dall’epitelio posteriore della vescicola del cristallino e riempiono il suo intero lume. Le cellule delle fibre secondarie iniziano ad allungarsi nella regione dell’arco della lente; le fibre dai lati opposti si incontrano al polo anteriore e posteriore, e danno origine alle suture della lente (che sono a forma di Y nella vista tridimensionale). Il passo finale nella differenziazione del cristallino è la degradazione dei nuclei cellulari e dei mitocondri, che ha luogo intorno al momento della nascita nel topo (modificato secondo Graw, 2003; con il permesso del Nature Publishing Group).
Entrambe le cellule delle fibre primarie e secondarie perdono i loro mitocondri e nuclei cellulari durante il processo di differenziazione finale: per le fibre primarie, ha luogo nei topi a E17/E18 e si conclude 2 settimane dopo la nascita, quando i topi aprono le palpebre (Vrensen et al., 1991). Le cellule delle fibre secondarie, che circondano le cellule delle fibre primarie, perdono i loro organelli, quando si spostano dalla corteccia esterna a quella interna (Kuwabara e Imaizumi, 1974).
Le cellule epiteliali anteriori, tuttavia, rimangono mitoticamente attive come una nicchia di cellule staminali che producono cellule delle fibre secondarie. Queste cellule secondarie della lente sono cellule differenziate terminalmente e perdono anche i loro organelli, quando vengono premute più in profondità nella lente dalle successive cellule della fibra.
Nel pesce zebra, tuttavia, si verificano diverse differenze nello sviluppo e nella differenziazione della lente. In particolare, l’allungamento delle cellule di fibre primarie avviene in modo circolare, dando luogo a un nucleo di lente embrionale con gusci concentrici di fibre. La spaziatura molto stretta dei nuclei delle fibre secondarie differenzianti in una zona stretta vicino all’epitelio equatoriale, tuttavia, suggerisce che la differenziazione delle cellule delle fibre secondarie si discosta da quella descritta per le lenti dei mammiferi o degli uccelli. A causa di queste differenze, si dovrebbe essere cauti quando si estrapolano i risultati sul pesce zebra allo sviluppo o alla funzione della lente del topo o dell’uomo (Dahm et al., 2007).
Nei topi, almeno due geni, Pitx3 e Foxe3, caratterizzano l’importanza della natura transitoria dello stadio del gambo della lente. Negli embrioni di topo, Pitx3 è espresso nella lente in sviluppo a partire da E11, prima nella vescicola della lente, e più tardi nell’epitelio anteriore e nell’equatore della lente. Mutazioni nelle regioni regolatrici o codificanti del gene Pitx3 hanno dimostrato di causare il fenotipo dell’afachia (ak) o dei topi senza occhi (eyl) mutanti, che mancano di lenti e pupille (Rieger et al., 2001; Rosemann et al., 2010; Semina et al., 2000). In questi topi, il peduncolo della lente persiste per diversi giorni portando infine ad una degradazione della vescicola rudimentale della lente, e il tessuto retinico riempie l’intero globo oculare. Poiché Pitx3 è espresso anche nei neuroni dopaminergici della substantia nigra, questi topi sono anche ottimi modelli per la malattia di Parkinson (Rosemann et al., 2010). In contrasto con il topo, mutazioni nel PITX3 umano causano disgenesi mesenchimale del segmento anteriore (ASMD; Semina et al., 1998).
I topi ak/ak hanno un fenotipo oculare che è molto simile ai topi dyl (lente disgenica), indicando che entrambi i geni sono coinvolti nello stesso processo biologico. Blixt et al. (2000) hanno dimostrato che il fenotipo dyl è mediato da una mutazione nel gene Foxe3. Nel topo, FoxE3 è espresso nell’occhio in via di sviluppo intorno a E9.5, all’inizio dell’induzione del placode della lente (Fig. 10.2). Come il placode della lente si forma, l’espressione di FoxE3 aumenta e diventa confinata alla vescicola della lente mentre si stacca dall’ectoderma superficiale. Due mutazioni all’interno del dominio di legame al DNA di FoxE3 sono state identificate nei topi dyl. Negli esseri umani, le mutazioni in FOXE3 sono responsabili della disgenesi ottica del segmento anteriore (ASOD). A causa del modello di espressione di FOXE3 e del fenotipo variabile dei topi dyl eterozigoti, una piccola coorte di pazienti con l’anomalia di Peters in cui nessuna mutazione PAX6 potrebbe essere rilevata è stata esaminata per le mutazioni FOXE3. Uno dei pazienti si è rivelato eterozigote per una sostituzione Arg90Leu che colpisce il dominio di legame al DNA di FOXE3 (Ormestad et al., 2002).
Il secondo passo importante è l’allungamento delle cellule nella metà posteriore della vescicola del cristallino che la riempie di cellule di fibra primaria. Nel mutante murino “chiazze opache nel cristallino”, una mutazione puntiforme colpisce la regione di base di Maf (codificata da un oncogene, responsabile del fibrosarcoma muscoloaponeurotico) e impedisce la corretta formazione delle fibre primarie del cristallino portando ad un fenotipo che è simile alla cataratta pulverulenta in una famiglia umana (Lyon et al., 2003). Il MAF dei mammiferi è espresso nel placode della lente e nella vescicola della lente, e più tardi nelle fibre della lente primaria.
Similmente, Puk et al. (2008) hanno recentemente caratterizzato un nuovo mutante di topo indotto da etil nitroso-urea (ENU) con un fenotipo di occhi piccoli e una vescicola della lente vuota nello stato omozigote. In questo caso, è stata identificata una mutazione nel gene Gjf1 (chiamato anche Gje1). Nel topo, il gene Gjf1 codifica una proteina simile alla connexina di 23,8 kDa, che viene espressa nella parte posteriore della vescicola della lente, dove inizia l’allungamento della fibra primaria. Nei mutanti, il modello di espressione di Pax6, Prox1, Six3 e Crygd è modificato, ma non quello di Pax2. Il gene Gjf1 è pensato per essere essenziale per la formazione delle fibre del cristallino primario (Puk et al., 2008) e potrebbe essere considerato un bersaglio a valle del fattore di trascrizione c-Maf; mutazioni nel corrispondente gene Maf portano ad un fenotipo simile nel topo (Lyon et al., 2003; Perveen et al., 2007). Al momento, non è chiaro se ci sia una controparte umana funzionale del gene Gjf1 del topo.
Un terzo fenotipo senza allungamento delle fibre del cristallino primario è causato dal knockout del gene Pparbp (che codifica per la proteina legante il recettore attivatore del perossisoma proliferatore; Crawford et al., 2002). La relazione tra queste tre proteine funzionalmente distinte per la formazione delle cellule della fibra primaria del cristallino non è ancora chiara.
Oltre a questi tre geni, anche la segnalazione Wnt potrebbe avere un ruolo nell’allungamento delle cellule della fibra primaria. Faber et al. hanno riportato nel 2002 una forma dominante-negativa del recettore Bmp 1b (simbolo del gene: Bmpr1b) in topi transgenici. Questi mutanti topi transgenici mostrano un’inibizione dello sviluppo delle cellule della fibra primaria, tuttavia, in modo asimmetrico: è apparso solo sul lato nasale della lente nella metà ventrale. Gli autori hanno concluso che stimoli di differenziazione distinti potrebbero essere attivi in diversi quadranti.
Sul lato anteriore, le cellule epiteliali della lente rimangono le uniche cellule mitoticamente attive nella lente. Esse sono caratterizzate da un’espressione continua di diversi geni Wnt: tuttavia, i dati di espressione dettagliati riportati non solo sono diversi tra pulcini e topi, ma variano anche tra diversi ceppi di topi (per i dettagli, vedere una revisione di de Iongh et al., 2006). Tuttavia, rimane chiaro che i geni della via di segnalazione Wnt sono espressi prevalentemente nelle cellule epiteliali della lente. Coerentemente, i recettori Fzd (simboli genici: Fzd1-8) e i co-recettori Lrp5 e Lrp6, i geni Sfrp1-3 e Dkk1-3 hanno anche dimostrato di essere espressi durante lo sviluppo della lente. Essi sono principalmente presenti nelle cellule epiteliali; l’unica eccezione è Fzd6 che è sempre più espresso nelle cellule di fibra che si differenziano (de Iongh et al., 2006). Come esempio, sono stati analizzati mutanti lrp6 null che mostrano (oltre ad alcuni altri difetti; vedi il database MGI) occhi piccoli e lenti aberranti caratterizzate da un epitelio anteriore incompletamente formato con conseguente estrusione delle fibre della lente nello stroma corneale sovrastante (Stump et al., 2003).
Tuttavia, l’innesco chiave per la differenziazione delle cellule delle fibre della lente è la segnalazione Fgf. Uno dei risultati più significativi ha dimostrato in espianti di lenti di ratto che diverse concentrazioni di Fgf2 (precedentemente noto come “Fgf di base” o “bFGF”) sono responsabili della proliferazione delle cellule del cristallino, della migrazione e della differenziazione delle cellule delle fibre del cristallino (McAvoy e Chamberlain, 1989). Dal momento che è ancora sconosciuto quale dei diversi Fgfs sono coinvolti nell’induzione della lente (Smith et al., 2010), la ricerca si è concentrata sui recettori Fgf. Come accennato in precedenza, gravi difetti nell’allungamento delle cellule della lente si sono verificati in lenti prive di tre geni recettori Fgf (Fgfr1-3; Zhao et al., 2008). Segnalazione Fgf è anche necessario per innescare il percorso non canonico Wnt (cioè, indipendente dalla β-catenina) nelle cellule epiteliali del cristallino; negli espianti del cristallino, porta all’accumulo di β-cristallina, un marcatore per la differenziazione delle cellule della fibra (Lyo e Joo, 2004).
Il cristallino maturo contiene diverse classi di proteine strutturali: le cristalline (α-, β-, γ-, δ-, μ-, ζ-cristalline), proteine transmembrana (come MP19 e MIP26, e le connexine 43, 46, e 50), alcuni collageni, e proteine del citoscheletro e dei filamenti intermedi. Le mutazioni nei geni corrispondenti (o in specifici fattori di trascrizione) portano a squilibri funzionali e a opacità del cristallino (cataratta). L’età di insorgenza delle cataratte e la loro modalità di ereditarietà dipendono dall’espressione dei geni corrispondenti e dal dominio interessato dalla mutazione sottostante. In totale, ∼60 geni diversi sono noti per essere responsabili della formazione della cataratta nei topi e negli esseri umani. Una discussione dettagliata delle mutazioni corrispondenti e delle loro conseguenze funzionali va oltre lo scopo di questo capitolo; recensioni corrispondenti a questo particolare argomento sono state pubblicate recentemente dall’autore (Graw, 2009a,b).