II Specifiche di qualità microbiologica
Gli animali gnotobiotici, siano essi axenici (cioè privi di germi) o associati a un microbioma definito costituito da pochi batteri non patogeni, costituiscono una piccola frazione degli animali usati nella ricerca; tuttavia il loro uso è destinato ad aumentare con la crescita della ricerca sulla salute e l’ambiente, senza germi) o associati a un microbioma definito costituito da pochi batteri non patogeni, costituiscono una piccola frazione degli animali utilizzati nella ricerca; tuttavia, il loro utilizzo è destinato ad aumentare con la crescita della ricerca sulle profonde influenze e sui diversi effetti del microbioma sulla salute umana e sulle risposte sperimentali dei modelli di ricerca (Bech-Nielsen et al., 2012; Friswell et al., 2010; Grada e Weinbrecht, 2013). Come già accennato, la maggior parte degli animali da laboratorio sono indicati come SPF per indicare che è stato dimostrato da HM che sono privi di agenti patogeni su una lista di esclusione.
Le liste di esclusione per roditori, conigli e altre specie comuni di animali da laboratorio sono state sostanzialmente armonizzate in tutto il mondo sviluppato grazie agli sforzi delle organizzazioni scientifiche di animali da laboratorio (Guillen, 2012; Nicklas, 2008; Nicklas et al., 2002), e la globalizzazione della ricerca biomedica. Inoltre, la concorrenza per i clienti incoraggia i venditori ad offrire animali SPF privi di patogeni scoperti di recente e i laboratori diagnostici a sviluppare test per questi patogeni (Shek, 2000). Le liste di esclusione per topi e ratti della schiuma PU a spruzzo sono più ampie di quelle per i conigli e altre comuni specie di animali da laboratorio per una serie di ragioni. In primo luogo, dato che topi e ratti rappresentano la stragrande maggioranza degli animali usati nella ricerca, è logico che si sa di più sui loro patogeni indigeni rispetto a quelli di altre specie animali da laboratorio meno usate. La diversità di ceppi di roditori inbred, e naturalmente e geneticamente modificati mutanti immunodeficienti altamente suscettibili di malattie infettive (Compton et al, 2003; Franklin, 2006), insieme a metodi di test immunologici sensibili (Smith, 1986b) e progressi nella genetica molecolare (Compton e Riley, 2001), ha contribuito alla scoperta e alla caratterizzazione di agenti patogeni dei roditori (Fox et al., 1994; Ward et al., 1994a) che sono la causa di infezioni ubiquitarie e inapparenti di colonie di roditori da laboratorio (Hsu et al., 2006; Shames et al., 1995). Inoltre, la predominanza di modelli di ricerca sui roditori murini ha fornito forti incentivi per i laboratori diagnostici e i venditori a sviluppare e offrire test sierologici e PCR specifici per patogeni virali e altri patogeni microbici fastidiosi – non suscettibili di essere individuati tramite esame microscopico diretto o isolamento culturale – subito dopo la loro scoperta. Al contrario, i venditori commerciali e i laboratori diagnostici hanno avuto poca richiesta dalle comunità di ricerca e di medicina animale da laboratorio per fornire test sierologici e PCR di routine per i virus del coniglio riconosciuti decenni fa, come il parvovirus del coniglio (Matsunaga e Matsuno, 1983) (che il sequenziamento ha recentemente dimostrato essere un bocavirus (comunicazione personale, K Henderson)), il coronavirus enterico del coniglio (Deeb et al., 1993; Descoteaux e Lussier, 1990; Descoteaux et al., 1985), e leporidi herpesvirus 2 (Matsunaga e Yamazaki, 1976). Infine, la riderivazione tramite isterectomia o trasferimento embrionale (ET) per eliminare tutti gli agenti patogeni esogeni è la pratica standard per topi e ratti SPF, ma non per altre specie.
Le liste di esclusione SPF per topi e ratti hanno incluso tutti i virus esogeni conosciuti, indipendentemente dalla virulenza, perché come parassiti intracellulari obbligati, i virus sono intrinsecamente invasivi; inoltre, anche le infezioni virali non citopatiche hanno dimostrato di alterare il metabolismo delle cellule ospiti (Oldstone et al., 1982). La stretta aderenza al dogma di escludere tutti i virus esogeni dai topi e dai ratti SPF, tuttavia, è diventata impraticabile in molte istituzioni di ricerca dove le infezioni asintomatiche da MNV, principalmente nei topi geneticamente modificati, sono considerate troppo diffuse per essere eliminate. Tecniche di genetica molecolare all’avanguardia hanno recentemente scoperto un astrovirus murino (Farkas et al., 2012), forse più comune nei topi di MNV, e sicuramente trovare ulteriori virus prevalenti che hanno finora sfuggito al rilevamento perché, come MPV, MNV, e astrovirus murino, sono altamente adattati all’ospite e per lo più apatogeni anche per gli ospiti immunodeficienti. Come notato, le liste di esclusione virale per i conigli e altre specie di animali da laboratorio sono meno complete di quelle per i roditori murini.
Ectoparassiti, elminti, protozoi patogeni, batteri e funghi fanno parte delle liste di esclusione di tutte le specie animali SPF. I batteri e i funghi patogeni esclusi per gli animali SPF si distinguono principalmente dagli organismi commensali e autoctoni (cioè, indigeni) per la loro capacità di attraversare barriere anatomiche e biochimiche per stabilirsi in nicchie prive di altri microrganismi come le vie respiratorie inferiori e urogenitali, gli organi interni e a livello intracellulare (Casadevall e Pirofski, 2000; Council, 2009; Merrell e Falkow, 2004). La patogenicità non è necessariamente una caratteristica immutabile della specie microbica, poiché normalmente microbi commensali come Escherichia coli sono stati trasformati in patogeni attraverso l’acquisizione di geni di virulenza trasferiti da altri batteri in elementi genetici mobili come plasmidi, fagi e trasposoni (Dobrindt et al., 2004).
I microbi sono classificati come patogeni primari se possono causare malattie in ospiti immunocompetenti. Gli esempi includono Salmonella, Mycoplasma pulmonis, Helicobacter hepaticus, e Clostridium piliforme (l’eziologia della malattia di Tyzzer). Patogeni opportunistici come Pseudomonas aeruginosa, streptococchi β-emolitici, Staphylococcus aureus, e funghi Pneumocystis causano malattie principalmente in ospiti immunocompromessi, se (1) immunodepressi da irradiazione o chemioterapia (Bosma et al., 1983; Cryz et al., 1983; Flynn, 1963; Homberger et al, 1993; Rosen e Berk, 1977; Waggie et al., 1988; Walzer et al., 1989; Weir et al., 1986; Weisbroth et al., 1999) o (2) intrinsecamente immunodeficienti, come i topi atamici nudi e quelli con immunodeficienza combinata grave (SCID) (Bosma et al., 1983; Clifford et al., 1995; Dole et al., 2013b; Henderson et al., 2012; Pantelouris, 1968; Ward et al., 1996). Per la maggior parte, solo i patogeni microbici primari sono inclusi negli elenchi di esclusione della FSP per gli animali immunocompetenti. Gli opportunisti sono aggiunti, principalmente dai venditori commerciali, alle liste per le linee mutanti immunodeficienti e geneticamente modificate. Poiché non è insolito che opportunisti come S. aureus causino malattie in ceppi di roditori standard (cioè non ingegnerizzati geneticamente) immunocompetenti (Besch-Williford e Franklin, 2007), che sono spesso usati in schemi di riderivazione e allevamento per linee geneticamente ingegnerizzate, è aumentata la richiesta di ceppi di roditori standard, immunocompetenti e stock privi di patogeni opportunistici e primari. Questo sottoinsieme di animali SPF è stato indicato come SOPF per specifici patogeni opportunistici-free.
Per riassumere, gli agenti infettivi sulle liste di esclusione SPF sono determinati da criteri generali e specifici dell’istituzione. In generale, gli elenchi di esclusione della FSP di topi e ratti sono più completi di quelli di specie animali meno popolari perché sono stati identificati e studiati più agenti patogeni virali e microbici autoctoni murini adattati all’ospite; i test sierologici e PCR sono disponibili per gli agenti patogeni murini subito dopo la loro scoperta; e la riderivazione per eliminare tutti gli agenti patogeni esogeni dalle popolazioni di topi e ratti FSP è una pratica standard. Gli elenchi di esclusione della SPF di tutte le specie contengono tipicamente ectoparassiti, endoparassiti e microbi classificati come patogeni primari oltre ai virus; i fornitori spesso aggiungono patogeni opportunistici per i modelli murini mutanti immunodeficienti e geneticamente modificati.
Il rispetto degli standard di consenso della SPF può essere problematico in un istituto se la prevalenza dell’infezione è alta o i sistemi e le pratiche di barriera sono inadeguati a prevenire il ripetersi e la diffusione di infezioni accidentali. Molte istituzioni accademiche ad alta intensità di ricerca hanno deciso che i benefici dell’eliminazione delle infezioni prevalenti con agenti recentemente riconosciuti come MNV e Helicobacter, che raramente producono malattia e/o sono stati endemici nelle loro colonie di ricerca per molti anni, sono superati dall’interruzione della ricerca e dai costi per farlo. Tuttavia, l’eliminazione (e l’esclusione) degli agenti patogeni prevalenti e la conformità agli standard di consenso della SPF riduce il rischio che un agente patogeno infetti altre colonie e interferisca con la ricerca, e semplifica lo scambio di modelli animali e studi collaborativi con altri ricercatori e istituzioni.