Abstract
Obiettivo. Il test del pepsinogeno sierico ha un limite nel suo potere predittivo come biomarcatore non invasivo per lo screening del cancro gastrico. Abbiamo voluto indagare se la combinazione di TFF3 e pepsinogeno possa essere un biomarcatore efficace per l’individuazione del cancro gastrico anche nelle fasi iniziali. Metodi. In totale, 281 pazienti con cancro gastrico precoce (EGC), sottoposti a dissezione sottomucosa endoscopica in Corea, e 708 individui sani dal Giappone sono stati arruolati nella coorte di derivazione. La coorte di convalida comprendeva 30 pazienti coreani con EGC e 30 donatori di sangue coreani sani. I livelli sierici di TFF3 sono stati esaminati utilizzando un test di immunosorbimento enzimatico. Risultati. Utilizzando un cutoff di 6,73 ng/mL nella coorte di derivazione, la sensibilità della combinazione di test per il rilevamento dell’EGC era superiore (87,5%) a quella del TFF3 (80,4%) o del solo test del pepsinogeno (39,5%). Allo stesso modo, nella coorte di convalida, la sensibilità del TFF3 più pepsinogeno era superiore (90,4%) a quella del TFF3 (80,0%) o del solo test del pepsinogeno (33,3%). Conclusioni. La combinazione di TFF3 e pepsinogeno nel siero è un biomarcatore non invasivo più efficace per l’individuazione del cancro gastrico rispetto al pepsinogeno o al solo TFF3, anche in EGC. Questo studio è registrato con NCT03046745.
1. Introduzione
Il cancro gastrico è la terza causa di morte per cancro nel mondo. Circa la metà dei casi di cancro gastrico sono diagnosticati durante le fasi avanzate. Una delle ragioni di ciò è l’invasività degli esami di screening esofagogastroduodenoscopici (EGD) che porta i pazienti ad evitare i test necessari. Il limite del test del pepsinogeno come metodo di screening sierologico non invasivo è che il valore di cutoff ottimale potrebbe essere influenzato da diversi fattori, come l’infezione da H. pylori, l’età, il sesso, e il metodo stesso del test.
La famiglia del fattore trefoil (TFF) dei peptidi comprende piccole molecole (12-22 kDa) che sono secrete dal tratto gastrointestinale dei mammiferi. Sono estremamente stabili in condizioni acide e resistenti alla degradazione termica e alla digestione proteolitica. I TFF costituiscono una famiglia di tre peptidi (TFF1, TFF2 e TFF3) che sono ampiamente espressi in modo tessuto-specifico nel tratto gastrointestinale. TFF3 è espresso nelle cellule del calice dell’intestino tenue e crasso e nella metaplasia intestinale nello stomaco. Il siero TFF3 ha dimostrato di essere un migliore strumento di screening potenziale per il cancro gastrico rispetto al pepsinogeno in Giappone.
Queste caratteristiche di TFF3 ci hanno spinto ad analizzare se il siero TFF3 può essere un biomarcatore di cancro gastrico precoce (EGC) nei coreani, così come nella popolazione giapponese. Non ci sono studi precedenti sul TFF3 sierico come biomarcatore nella popolazione EGC senza cancro gastrico avanzato (AGC). Poiché l’individuazione del cancro in fase iniziale è associata a una migliore sopravvivenza, la nostra ipotesi è che la combinazione di TFF3 con il pepsinogeno possa migliorare la sensibilità dell’individuazione dell’EGC. Così, abbiamo studiato se la combinazione di test TFF3 e pepsinogeno nel siero potrebbe essere uno strumento non invasivo più efficace per la rilevazione di EGC.
2. Materiali e metodi
2.1. Soggetti
2.1.1. Popolazione di studio della coorte di derivazione
Il gruppo di pazienti era composto da 281 pazienti EGC sottoposti a dissezione endoscopica sottomucosa presso il Kyungpook National University Medical Center in Corea da gennaio 2011 a maggio 2013. Abbiamo ottenuto campioni di sangue da tutti i pazienti prima del loro trattamento endoscopico. Il gruppo di controllo era composto da 708 donatori di sangue sani, maschi e femmine, che avevano ricevuto un controllo sanitario presso la Yamanaka Clinic in Giappone da ottobre 2011 a dicembre 2012. I campioni bioptici per questo studio sono stati forniti dalla National Biobank of Korea, Kyungpook National University Hospital (KNUH), che è supportata dal Ministero della Salute, del Benessere e degli Affari. Tutti i materiali derivati dalla Biobanca Nazionale della Corea, KNUH, sono stati ottenuti sotto protocolli approvati dal comitato di revisione istituzionale.
2.1.2. Valore TFF3 nella coorte di convalida
Nella coorte di derivazione dello studio attuale, il gruppo di controllo era composto da individui giapponesi, e non abbiamo ottenuto i risultati del pepsinogeno sierico nel gruppo di controllo. Per testare i nostri risultati in un’altra coorte di convalida con pazienti e controlli dello stesso paese, era necessaria la coorte di convalida coreana. La coorte di convalida era una coorte indipendente, contenente 30 pazienti coreani con EGC da agosto 2016 a dicembre 2016 e 30 donatori di sangue coreani di controllo sani che hanno ricevuto un controllo della salute, compresa l’EGD, da agosto 2016 a dicembre 2016. I loro dati sono stati raccolti e analizzati prospetticamente per convalidare il valore TFF3. I protocolli di studio utilizzati per i soggetti della coorte di convalida erano identici a quelli utilizzati per i soggetti della coorte di derivazione. La validità della combinazione di TFF3 e pepsinogeno per il rilevamento di EGC negli individui coreani è stata valutata mediante analisi delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC).
2.2. Metodi
2.2.1. Costruzione di plasmidi di espressione TFF3 umano
L’acido deossiribonucleico complementare (cDNA) TFF3 umano è stato clonato dal cDNA Marathon-Ready del piccolo intestino umano (Clontech, Mountain View, CA, USA) mediante reazione a catena della polimerasi. Per His-tagged espressione Escherichia coli, i frammenti di cDNA umano TFF3 sono stati inseriti nel pET-21a (+) vettore (Novagen) per creare pET-hTFF3-His. Espressione e purificazione di TFF3 umano ricombinante
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL batteri (Stratagene, Santa Clara, CA, USA) sono stati trasformati con il plasmide pET-hTFF3-His e poi coltivati in brodo di lisogenia a 37°C. L’espressione della proteina ricombinante è stata indotta incubando le cellule con 1 mmol/L di isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside per 5 ore. Il pellet batterico è stato raccolto, le frazioni proteiche solubili sono state estratte mediante sonicazione in 0.2% Triton X-100 e 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), e le TFF umane ricombinanti sono state purificate mediante cromatografia Ni-Resin (Invitrogen, Tokyo, Giappone). Le TFF umane ricombinanti sono state eluite dalla colonna Ni-Resin con 0,5 mol/L imidazolo, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) e 0,5 mol/L NaCl. Ogni frazione di eluizione è stata analizzata eseguendo l’elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato di poliacrilammide e l’analisi Western blot. Le concentrazioni delle TFF umane ricombinanti purificate sono state misurate utilizzando un test delle proteine (Bio-Rad Laboratories Inc., Tokyo, Giappone). Immunodosaggio per TFF3, Pepsinogeno I, Pepsinogeno II, e stato di infezione da Helicobacter pylori
I livelli di TFF3 nel siero sono stati misurati eseguendo un saggio di immunosorbimento enzimatico (ELISA). Gli antisieri sono stati preparati da conigli immunizzati con TFF umani. La sensibilità del TFF3 era di 30 pg/mL. I livelli sierici di pepsinogeno I e pepsinogeno II sono stati misurati usando il test immunologico turbidimetrico potenziato al lattice (Hitachi Ltd, Tokyo, Giappone), ed è stato calcolato il rapporto pepsinogeno I/pepsinogeno II.
Una condizione di infezione da H. pylori positiva dipendeva da almeno uno dei seguenti test che mostravano la prova dell’infezione: istologia, test rapido dell’ureasi, e -urea breath test.
2.3. Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software JMP7 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) o SPSS versione 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). La media delle variabili è stata confrontata tra due gruppi utilizzando un t-test. La curva ROC per ogni valutazione è stata utilizzata per estrarre il punto di cutoff corrispondente, che può essere utilizzato per discriminare diversi stati gastrici. A tal fine, l’area sotto ogni curva ROC è stata utilizzata per misurare la capacità discriminatoria del modello. Il valore risultante del punto di cutoff per ogni valutazione è stato applicato alla determinazione della sensibilità, specificità e odds ratio. Di conseguenza, sono stati calcolati gli intervalli di confidenza al 95%. Un valore su 2 lati inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
3. Risultati
3.1. Caratteristiche delle coorti di derivazione e convalida
Nella coorte di derivazione, c’erano 217 (75,8%) pazienti maschi nel gruppo EGC e quello del gruppo di controllo erano 272 (38,4%). L’età media dei pazienti nel gruppo del cancro era 63,4 ± 9,3 anni, e quella dei controlli era 67,4 ± 11,9 anni. Il tasso di infezione da H. pylori positivo nel gruppo del cancro era del 48,4%. Dei 281 tumori studiati, 256 (91,1%) sono stati classificati istologicamente come tipo differenziato e 25 (8,9%) come tipo indifferenziato (Tabella 1). Il livello medio di TFF3 nel siero dei pazienti con cancro gastrico era 9,37 ± 4,67 ng/mL, che era significativamente più alto rispetto a quello del gruppo di controllo (7,05 ± 3,28 ng/mL; ; Tabella 1, Figura 1).
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I dati sono presentati come media ± SD. TFF3: trefoil factor family 3; WD: adenocarcinoma ben differenziato; MD: adenocarcinoma moderatamente differenziato; PD: adenocarcinoma scarsamente differenziato; SRC: signet ring cell carcinoma; NA: non applicabile.
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Per la coorte di convalida, sono stati arruolati 30 pazienti EGC coreani e 30 soggetti di controllo sani coreani (Tabella 1). C’erano 21 (70,0%) pazienti maschi nel gruppo EGC e 15 (50,0%) nel gruppo di controllo. L’età media dei pazienti con EGC era di 59,5 ± 10,7 anni e quella dei controlli di 66,6 ± 12,0 anni. Il livello medio di TFF3 nel siero dei pazienti con cancro gastrico era 9,01 ± 4,21 ng/mL, che era significativamente superiore a quello del gruppo di controllo (6,92 ± 2,76 ng/mL; ).
3.2. Effetto dell’infezione da H. pylori sui livelli sierici di TFF3 nella coorte di derivazione
Per testare l’accuratezza diagnostica del TFF3 sierico per identificare l’infezione da H. pylori tra i pazienti con cancro, è stata eseguita l’analisi ROC (dati non mostrati). L’area sotto la curva ROC della TFF3 era 0,445.
Per testare l’accuratezza diagnostica della TFF3 sierica per identificare l’EGC, è stata eseguita l’analisi ROC. Sia per i pazienti H. pylori-positivi che per quelli Helicobacter pylori-negativi, la sensibilità, la specificità, l’odds ratio, l’area sotto la curva e il valore di cutoff della TFF3 erano rispettivamente 0,804, 0,576, 5,60, 0,729 e 6,73. I valori predittivi positivi e negativi per il TFF3 erano rispettivamente 0,430 e 0,881 (Figura 2(a)). Per valutare ulteriormente la TFF3, i pazienti sono stati divisi in base allo stato di infezione da H. pylori e poi è stata eseguita l’analisi ROC. L’area sotto la curva era 0,716 per i pazienti H. pylori-positivi (Figura 2(b)) e 0,740 per i pazienti H. pylori-negativi (Figura 2(c)).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.3. Tipi istologici e livelli sierici di TFF3 nella coorte di derivazione
Per verificare l’influenza dell’EGC sui livelli sierici di TFF3, il livello di TFF3 nel siero di ogni paziente è stato confrontato con i loro tipi istologici di EGC. Il cancro gastrico differenziato includeva casi con adenocarcinomi ben differenziati o moderatamente differenziati. Il cancro gastrico con istologia di tipo indifferenziato includeva casi con adenocarcinoma scarsamente differenziato o carcinoma a cellule ad anello di sigillo. I livelli sierici di TFF3 dei pazienti con il tipo differenziato e di quelli con il tipo indifferenziato di EGC non differivano significativamente (9,53 ± 4,83 ng/mL contro 7,66 ± 1,82 ng/mL, rispettivamente; ). D’altra parte, il livello sierico di TFF3 nei pazienti con EGC di tipo intestinale era significativamente più alto che nei pazienti con il tipo diffuso (9,54 ± 4,78 ng/mL contro 7,16 ± 1,89 ng/mL, rispettivamente; ; Figura 3). In qualsiasi altro stato patologico di EGC, come l’invasione sottomucosa o l’invasione linfovascolare, non c’era alcuna differenza significativa nei livelli sierici di TFF3 (dati non mostrati).
(a)
(b)
(a)
(b)
Abbiamo analizzato l’utilità della determinazione del livello TFF3 insieme al test del pepsinogeno. Il numero di pazienti con cancro gastrico e risultati positivi o negativi per entrambi i test nel presente studio è mostrato nella tabella 2. I valori di cutoff per definire un test del pepsinogeno positivo erano un livello di pepsinogeno I nel siero di <70 ng/mL e un rapporto pepsinogeno I/II nel siero di <3. Sotto questi valori di cutoff, 170 dei 281 pazienti con EGC hanno dimostrato di non avere il cancro con il solo screening del pepsinogeno. Tuttavia, quando il test TFF3 del siero è stato aggiunto allo screening del cancro gastrico, 135 dei 170 pazienti EGC che non erano stati identificati dal test del pepsinogeno potevano essere identificati dall’esame TFF3. D’altra parte, 20 dei 281 pazienti non sono stati individuati dall’esame TFF3 ma sono stati individuati dall’esame del pepsinogeno.
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TFF3: trefoil factor family 3. Test del pepsinogeno sierico (+): pepsinogeno I < 70 ng/mL e rapporto pepsinogeno I/II < 3.
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La sensibilità dei test individuali del pepsinogeno e del TFF3 era rispettivamente del 39,5% e dell’80,4%. Con il test combinato, la sensibilità per la presenza di cancro gastrico era dell’87,5%, che era superiore a quella del test TFF3 da solo.
3.5. Combinazione dei test TFF3 e pepsinogeno nel siero nella coorte di convalida coreana
Per verificare le prestazioni diagnostiche del test del pepsinogeno e del TFF3 nel siero per l’identificazione dell’EGC nella coorte di convalida coreana, è stata eseguita l’analisi ROC (Figura 4). La sensibilità, la specificità, l’odds ratio e l’area sotto la curva del test del pepsinogeno per il rilevamento dell’EGC secondo la definizione del test del pepsinogeno erano rispettivamente 0,333, 0,933, 7,00 e 0,633. Utilizzando il valore di cutoff di 6,73 ng/mL per il TFF3, quelli per il TFF3 erano rispettivamente 0,800, 0,433, 3,06, e 0,651. Quelli per la combinazione di TFF3 e il rapporto pepsinogeno l/ll erano 0,900, 0,367, 5,21 e 0,756, rispettivamente.
I valori predittivi positivi e negativi del rapporto pepsinogeno l/ll erano 0,833 e 0,583, rispettivamente, e quelli del TFF3 erano 0,585 e 0,684, rispettivamente. Quelli della combinazione di TFF3 e del rapporto pepsinogeno l/ll erano 0,587 e 0,786, rispettivamente.
4. Discussione
Il test del pepsinogeno è usato per lo screening del cancro gastrico in Giappone, dove la sensibilità del test negli studi basati sulla popolazione varia dal 71% all’84%, e la specificità varia dal 57% al 78%. Nel presente studio, abbiamo confrontato il TFF3 sierico con il test del pepsinogeno sierico come strumenti di screening sierologico per il rilevamento di EGC nei pazienti coreani. La sensibilità del test del pepsinogeno era del 39,5% nella coorte di derivazione, mostrando una sensibilità inferiore a quella degli studi giapponesi. Sembra che il test del pepsinogeno per il cancro gastrico sia facilmente influenzato da vari fattori, tra cui lo stato di H. pylori e il metodo stesso del test, e quindi non soddisfa i criteri di screening ideali. D’altra parte, il test TFF3 del siero ha mostrato una maggiore sensibilità (80,4%) rispetto al test del pepsinogeno per rilevare l’EGC nel nostro studio. Inoltre, i risultati del test TFF3 nel siero non sono stati influenzati dallo stato di H. pylori. Allo stesso modo, un recente studio giapponese su 1260 individui sani ha mostrato che i valori di TFF3 nel siero non erano considerevolmente influenzati dallo stato di H. pylori e dall’eradicazione. Gli autori hanno suggerito che il TFF3 sierico potrebbe essere un biomarcatore stabile di cancro gastrico anche dopo l’eradicazione di H. pylori in contrasto con il test del pepsinogeno. Poiché TFF3 non è espresso nelle cellule epiteliali dello stomaco ed è espresso solo nelle cellule goblet intestinali della metaplasia, i livelli sierici di TFF3 sono meno influenzati dall’infezione da H. pylori .
I TFF che consistono in TFF1, TFF2, e TFF3 sono altamente espressi nei tessuti contenenti cellule che producono muco. Svolgono un ruolo chiave nel mantenimento dell’integrità delle mucose e nella trasformazione oncogenica, nella crescita e nell’estensione metastatica dei tumori solidi. TFF3 è espresso nelle cellule del calice dell’intestino tenue e crasso così come nella metaplasia intestinale nello stomaco.
Dati recenti indicano che i TFF del siero, in particolare TFF3, potrebbero essere potenziali biomarcatori per l’individuazione del cancro gastrico. In uno studio giapponese condotto su 183 pazienti con cancro gastrico e 280 individui sani, utilizzando un cutoff di 3,6 ng/mL per TFF3, l’odds ratio per il cancro gastrico è aumentato significativamente (odds ratio 18,1; 95% intervallo di confidenza 11,2-29,2) e la sensibilità e la specificità per predire il cancro gastrico erano 80,9 e 81,0%, rispettivamente. Confrontando le curve ROC del rapporto pepsinogeno I/II, del TFF3 e del TFF3 più il rapporto pepsinogeno I/II, il TFF3 più il pepsinogeno è risultato avere risultati migliori per il marker di screening gastrico rispetto al pepsinogeno o al solo test TFF3. In un altro studio condotto su 192 pazienti con cancro gastrico e 1254 controlli, la sensibilità e la specificità del test del pepsinogeno per predire il cancro gastrico erano rispettivamente del 67% e dell’82%, mentre la combinazione del test TFF3 e del pepsinogeno nel siero ha mostrato una sensibilità dell’80 e una specificità dell’80% nel rilevare il cancro gastrico. Questi risultati precedenti sono coerenti con i risultati del nostro studio, su pazienti con EGC. Abbiamo anche confrontato la combinazione di TFF3 e pepsinogeno nel siero con il solo test TFF3 o pepsinogeno. La curva ROC del TFF3 per predire la presenza di EGC ha mostrato che la sensibilità, la specificità e l’area sotto la curva erano 80,4%, 57,6% e 0,729, rispettivamente, utilizzando un cutoff di 6,73 ng/mL nella coorte di derivazione. La sensibilità della combinazione di test (87,5%) per il rilevamento dell’EGC era superiore a quella del TFF3 (80,4%) o del solo test del pepsinogeno (39,5%). Allo stesso modo, nella coorte di convalida, la curva ROC del TFF3 ha mostrato che la sensibilità, la specificità e l’area sotto la curva erano 80,0%, 43,3% e 0,651, rispettivamente, utilizzando un cutoff di 6,73 ng/mL. L’area sotto la curva per il TFF3 più il rapporto pepsinogeno I/II (0,756) era superiore a quella del TFF3 da solo (0,651) o del rapporto pepsinogeno I/II da solo (0,633). Inoltre, la sensibilità del TFF3 più pepsinogeno (90,0%) era superiore a quella del TFF3 (80,0%) o del solo test del pepsinogeno (33,3%). TFF3 è un marcatore più utile del test del pepsinogeno per il rilevamento di EGC, e la combinazione di TFF3 sierico più pepsinogeno è più efficace di TFF3 o pepsinogeno soltanto.
Abbiamo anche valutato la relazione tra TFF3 e i tipi istologici di EGC secondo la differenziazione e la classificazione Lauren, rispettivamente. Abbiamo trovato che i livelli sierici di TFF3 nei pazienti con cancro gastrico di tipo differenziato erano più alti rispetto ai pazienti con istologia di tipo indifferenziato, anche se queste differenze non hanno mostrato significatività statistica (). I livelli sierici di TFF3 nei pazienti con cancro gastrico di tipo intestinale erano significativamente più alti di quelli con cancro di tipo diffuso (). Huang et al. hanno riportato concentrazioni più basse di TFF3 nel siero in pazienti cinesi con tumori gastrici di tipo differenziato e di tipo intestinale. Pertanto, i risultati del nostro studio non sono coerenti con il loro rapporto. Al contrario, il nostro studio è altamente coerente con il rapporto di Kaise et al. in Giappone, che ha trovato che la sensibilità del test TFF3 da solo e la combinazione dei test TFF3 e pepsinogeno nell’adenocarcinoma di tipo diffuso erano inferiori a quelli nel cancro di tipo intestinale. Poiché TFF3 è fortemente espresso dalle cellule del calice nell’epitelio della metaplasia intestinale dello stomaco (secondo l’istopatogenesi del cancro gastrico), ci si aspetterebbe un alto livello di TFF3 nel siero nei tumori gastrici di tipo intestinale e differenziato. Ulteriori studi di grandi dimensioni sono necessari per spiegare questi risultati controversi e le discrepanze tra gli studi precedenti.
L’EGD è un esame invasivo utilizzato per la diagnosi precoce del cancro gastrico, in particolare in molti soggetti asintomatici. I risultati positivi della combinazione di TFF3 e pepsinogeno nel siero per il cancro gastrico potrebbero essere utili per incoraggiare i pazienti a sottoporsi all’EGD.
Ci sono stati diversi limiti in questo studio. Una era la dimensione relativamente piccola del campione. Tuttavia, il nostro studio ha mostrato risultati simili attraverso due coorti indipendenti e questo è il primo studio sull’utilità diagnostica del TFF3, che ha incluso solo pazienti con EGC, e non AGC. In secondo luogo, la percentuale di EGC di tipo diffuso era piccola. Tuttavia, lo studio coreano precedente ha mostrato risultati simili e ha riferito che il valore diagnostico della TFF3 del siero per il cancro di tipo diffuso era in qualche modo diminuito rispetto a quello del cancro gastrico di tipo intestinale, anche se la percentuale di EGC era del 49,4%. In terzo luogo, i soggetti di controllo nella coorte di derivazione erano giapponesi sani e non coreani. Per superare questo e convalidare il presente studio, abbiamo analizzato una seconda coorte di controllo coreana indipendente e i risultati di entrambe le coorti erano simili. In quarto luogo, il nostro studio non ha mostrato la rilevabilità di lesioni precancerose, compresa la gastrite atrofica, da parte del TFF3.
In sintesi, questo studio ha dimostrato che il TFF3 sierico può essere un biomarcatore di EGC più efficace nei coreani rispetto al test del pepsinogeno. Inoltre, la combinazione del TFF3 e del test del pepsinogeno aveva un maggiore potere diagnostico come modalità di screening. Inoltre, i risultati hanno indicato la possibilità che il livello sierico di TFF3 sia associato al tipo istologico e al tipo di differenziazione dell’EGC. Sono necessari ulteriori studi di grandi dimensioni per confermare il forte potere predittivo del TFF3 sierico e i test combinati con TFF3 e pepsinogeno nei pazienti con AGC o EGC, nonché per chiarire il ruolo del TFF3 sierico come biomarcatore non endoscopico nello screening basato sulla popolazione per il cancro gastrico.
Discorso
Hyun Seok Lee è il primo autore.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano che non ci sono interessi concorrenti per quanto riguarda la pubblicazione di questo articolo.
Riconoscimenti
Questo studio (informazioni sulla sperimentazione clinica: NCT03046745) è stato supportato da una sovvenzione del National R&D Program for Cancer Control, Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (1631100).