Approcci non organici
Ad oggi, le linee cellulari epiteliali intestinali sono state i principali sistemi modello in vitro per valutare i processi di trasporto intestinale, mentre le linee cellulari enteroendocrine sono modelli comuni per studiare la secrezione di diversi ormoni intestinali. Un modello consolidato per gli enterociti del piccolo intestino è la linea cellulare CaCo-2 (o il sottoclone CaCo-2 TC7), derivata da un adenocarcinoma del colon. Questa linea cellulare è comunemente coltivata su piastre transwell fino a 3 o 4 settimane postconfluenza per studi sul trasporto intestinale di nutrienti, farmaci o altri composti utilizzando substrati marcati con radio o fluorescenza (Farrell et al., 2013; Ganapathy et al., 1995; Wang e Li, 2017). Le cellule HT-29 (e sottocloni) sono una linea cellulare umana di carcinoma del colon ben stabilita per la ricerca sui trasportatori intestinali, in particolare i trasportatori di zucchero (Delezay et al., 1995; Liu et al., 2016). Per studiare il ruolo dei trasportatori nel rilevamento dei nutrienti intestinali, tuttavia, sono necessarie altre linee cellulari. Le linee cellulari enteroendocrine più importanti utilizzate per studi sulla secrezione di ormoni intestinali sono la linea cellulare GLUTag murina (Emery et al., 2015), la linea cellulare STC-1 murina (Jiang et al., 2016), e la linea cellulare umana NCI-H716 (Pais et al., 2014). Nessuno di loro, tuttavia, riflette la complessa biologia delle cellule enteroendocrine in vivo (Kuhre et al., 2016). Le cellule enteroendocrine sono distribuite in tutto l’intestino tenue e crasso, e i loro modelli di espressione di diversi ormoni intestinali differiscono fortemente, a seconda della loro posizione all’interno del tratto intestinale (Habib et al., 2012). Per esempio, il numero di cellule che secernono GLP-1 (spesso chiamate cellule L) aumenta gradualmente dall’intestino prossimale a quello distale, mentre le cellule che secernono GIP (chiamate cellule K) diminuiscono. Così, le linee cellulari enteroendocrine, che sono tutte di derivazione tumorale, rappresentano sistemi modello molto semplici e artificiali per lo studio del rilevamento dei nutrienti, della secrezione di ormoni intestinali e dei meccanismi molecolari e regolatori sottostanti. Il vantaggio delle linee cellulari di mammiferi è che sono ben consolidate da numerosi laboratori in tutto il mondo. Ci sono molti dati scientifici disponibili, così come protocolli sperimentali stabiliti. Inoltre, sono facili da gestire e la coltivazione è economica. Tuttavia, tutte queste linee cellulari sono sistemi modello molto semplici e artificiali. Sono per lo più derivate da tumori e rappresentano solo un singolo tipo di cellula, non riflettendo la complessità della mucosa intestinale che comprende più tipi di cellule specializzate. Inoltre sono di solito coltivate in due dimensioni, il che non riflette l’architettura tridimensionale dell’intestino nativo.
In particolare, per gli studi sul rilevamento dei nutrienti e la secrezione di ormoni intestinali, la coltura cellulare intestinale primaria è un approccio di gran lunga migliore, ed è stato stabilito come un modello affidabile negli ultimi anni (Reimann et al., 2008). Le colture primarie coltivate da cripte intestinali isolate hanno il vantaggio di poter essere generate da diversi segmenti intestinali (Parker et al., 2012), e da topi (animali wild-type o knockout) (Diakogiannaki et al., 2013), o umani (Habib et al., 2013). Essi comprendono enterociti assorbenti, così come diversi sottotipi di cellule enteroendocrine, come si trovano nell’intestino nativo. Tuttavia, queste colture contengono enterociti scarsamente differenziati, e quindi non sono adatti per il rilevamento di trasportatori intestinali e recettori a livello proteico o funzionale. Sono un sistema di coltura a breve termine non adatto per esperimenti a lungo termine, e non possono essere fatti passare, il che aumenta il numero di animali da laboratorio necessari per la preparazione delle colture. Lo stesso vale per le cellule epiteliali intestinali isolate (Grossmann et al., 1998), che comprendono tutti i tipi di cellule della mucosa ma mostrano una vitalità molto limitata in vitro, e non rappresentano un epitelio intatto.
La stabilità a breve termine è anche un limite degli espianti di tessuto, come gli anelli intestinali estratti (Roder et al, 2014), o sacche intestinali da intestino di topo o ratto (Praslickova et al., 2012; Surampalli et al., 2016) che sono spesso utilizzati per studi di trasporto. Gli anelli intestinali estroflessi possono essere incubati con substrati marcati in vitro, o possono essere preparati in seguito alla somministrazione orale, per esempio, di substrati di trasporto marcati con radioattività nei roditori (Roder et al., 2014). Sacchi intestinali estroflessi possono anche essere utilizzati per studi di flusso, dal momento che i compartimenti luminali e basolaterali possono essere mirati separatamente. Tuttavia, la preparazione e la manipolazione non sono banali e richiedono una certa esperienza. Il vantaggio degli espianti di tessuto è che possono essere preparati da diversi segmenti intestinali, e le loro caratteristiche specifiche della regione in vivo sono conservate in vitro. L’espianto intestinale conserva la sua architettura nativa, e la mucosa è collegata al suo tessuto circostante come la sottomucosa o il muscolo, e sono inclusi neuroni, linfa, vasi sanguigni. A seconda della domanda scientifica, questo può essere un vantaggio o uno svantaggio. Il rilevamento intestinale delle sostanze nutritive e la successiva secrezione di ormoni intestinali è talvolta studiato nell’intestino perfuso di roditori (Kuhre et al., 2015). L’animale è anestetizzato e il lume intestinale è perfuso con gli stimolanti putativi ex vivo. Il fluido basolaterale viene raccolto e il contenuto dell’ormone intestinale viene analizzato. Questa tecnica non è tecnicamente facile, e gli ostacoli etici limitano l’ampio uso di questo metodo per gli studi sul rilascio di ormoni intestinali indotti dai nutrienti.
Un modello affidabile e consolidato utilizzato per studi sulle caratteristiche funzionali e la regolazione dei trasportatori intestinali è l’espressione eterologa in ovociti di Xenopus laevis (Hirsch et al., 1996). In seguito all’iniezione di mRNA, la proteina di interesse viene espressa nell’ovocita, e la cinetica di trasporto può essere studiata utilizzando substrati radio-marcati o approcci elettrofisiologici nel caso di trasportatori elettrogenici (Schulze et al., 2014; Stelzl et al., 2016). Questa tecnica è un ottimo strumento per studiare le caratteristiche funzionali di un particolare trasportatore, anche se la proteina bersaglio si trova in un ambiente artificiale e non sono presenti fattori regolatori, come sarebbe nella cellula di mammifero. Inoltre, la disponibilità di ovociti intatti e la complicata manipolazione, compresa l’iniezione degli ovociti, sono questioni critiche da considerare quando si applica questa tecnica. Sistemi di espressione eterologa molto più semplici sono il lievito e l’E. coli. Essi permettono la generazione di mutanti ricombinanti che, una volta generati, possono essere coltivati o fermentati su larga scala, fornendo elevate quantità di proteine. Anche se economici e facili da gestire, questi microrganismi sono sistemi modello molto semplificati per lo studio delle proteine dei mammiferi, e in particolare delle grandi proteine di membrana. I problemi che spesso si verificano sono il misfolding della proteina, o il mancato inserimento della membrana. Pertanto, questi sistemi sono piuttosto più utili per la caratterizzazione strutturale di proteine purificate o domini proteici (Beale et al., 2015) che per studi dettagliati sulla funzione e la regolazione dei trasportatori dei mammiferi.
Nuovi e promettenti approcci che sono stati stabiliti nel recentissimo passato sono modelli tridimensionali di colture cellulari di mammiferi. Linee cellulari intestinali come CaCo-2 o HT-29 sono coltivate su scaffold, creando un’architettura più simile all’intestino che porta a una migliore differenziazione (Chen et al., 2015). Altri modelli tridimensionali sono coltivati direttamente da cellule epiteliali del piccolo intestino umano e miofibroblasti su membrane microporose rivestite (Maschmeyer et al., 2015a; Maschmeyer et al., 2015b), e non possono essere moltiplicati in vitro. Questi modelli hanno il potenziale per essere stabiliti per studi di trasporto di nutrienti o farmaci, e le culture cresciute da cellule epiteliali intestinali umane comprendono anche diversi tipi di cellule della mucosa, ma non cellule enteroendocrine. Lo stesso vale per i tessuti tridimensionali bio-stampati, un’altra tecnologia che è sorta molto recentemente e ha guadagnato un’enorme attenzione. Questo approccio ha più valore per la medicina rigenerativa e i trapianti che per la ricerca sperimentale (Murphy e Atala, 2014). Il bioprinting di diversi tessuti, tra cui cuore, pelle e ossa, è stato stabilito con successo, ma i tessuti intestinali bioprintati sono rari ad oggi e devono essere ulteriormente migliorati (Wengerter et al., 2016).