Canali e trasportatori di ioni cloruro: da curiosità della natura e fonte di malattie umane a bersagli farmacologici

Questo soddisfa praticamente ogni caso dall’aula al laboratorio di ricerca fino a quando non consideriamo i canali del cloruro. Sappiamo che esistono, sono importanti e potrebbero essere buoni bersagli farmacologici in diverse aree di malattia, ma fino a poco tempo fa, sono rimasti un po’ stigmatizzati e fuori moda nel mondo della terapeutica. La mancanza di ligandi selettivi non ha aiutato affatto. L’unica eccezione è stata il recettore GABA-A che è accoppiato a un canale intrinseco di cloruro che si apre al legame del neurotrasmettitore inibitorio GABA. Le benzodiazepine hanno potenziato questo recettore da quando il Valium è diventato disponibile negli anni ’60, fornendo effetti sedativi e anticonvulsivanti. Questo introduce un concetto importante: ci sono diverse famiglie di geni e diversi tipi di proteine che possono essere descritti come canali del cloruro.

Questo è in contrasto con quello che capiamo dei canali ionici cationico-selettivi dove c’è poca flessibilità nella struttura della proteina che può formare un poro che è selettivo per il potassio, il sodio o il calcio; la diversità di questi canali ionici è determinata dalle variazioni nei domini proteici distinti dal poro che influenzano il comportamento di apertura-chiusura. Ad essere onesti, non sembrano esserci molte ragioni fisiologiche per cui un canale per gli anioni dovrebbe mostrare una selettività per il cloruro, dato che c’è poco ruolo fisiologico nel trasporto di membrana di altri alogenuri o piccoli anioni; qualsiasi canale per gli anioni sarà per default un canale per il cloruro da un punto di vista fisiologico. D’altra parte, le correnti di membrana del potassio, del sodio e del calcio giocano ognuna ruoli fondamentali diversi e la permeabilità selettiva della membrana a questi cationi è cruciale per la funzione cellulare e la vita stessa.

I recettori GABA-A sono membri delle famiglie di canali ionici cys-loop pentamerici ligando-gated, che includono diversi tipi di canali neurotrasmettitoriali eccitatori e inibitori-gated. La proteina CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator) è un canale del cloruro regolato dal nucleotide. È un membro della diversa famiglia di trasportatori ATP-binding cassette (ABC) ed è l’unico che non sembra trasportare alcun substrato attraverso una membrana, ma piuttosto funziona come un canale del cloruro. La famiglia CLC dei canali del cloruro voltaggio-gated deriva da un’altra famiglia di geni distinta e ha una struttura generale unica tra le proteine di membrana. Questa famiglia di proteine ha portato a molte sorprese negli ultimi 30 anni e i membri di questa famiglia saranno introdotti qui e anche come potrebbero essere considerati bersagli farmacologici.

Altri sviluppi interessanti dal campo dei canali del cloruro sono emersi in seguito all’identificazione molecolare delle proteine alla base dei canali del cloruro attivati dal calcio (ClCa). Funzionalmente, conosciamo da tempo i loro ruoli fisiologici, ma la recente identificazione molecolare delle proteine del canale ha permesso lo sviluppo di strumenti molecolari e farmacologici per sondare e alterare la loro attività. Questa revisione si concentra sul potenziale farmacologico del targeting dei canali ClCa e delle proteine CLC; la loro funzione e localizzazione subcellulare sono riassunte nella Figura 1.

Un’introduzione alle proteine CLC

I nove membri di questa famiglia di proteine sono CLC-1 a 7, CLC-KA e KB. Il membro fondatore, CLC-1, è il canale del cloruro voltaggio-gated del muscolo scheletrico e sarà discusso di seguito. Molti studi funzionali sono stati condotti su un omologo con il titolo onorifico di CLC-0, isolato dall’organo elettrico Electroplax, che permette alla razza di stordire le sue vittime acquatiche. La ricostituzione di CLC-0 in bilayer lipidici e la registrazione elettrofisiologica delle correnti che scorrono attraverso singoli canali ionici hanno rivelato una proprietà intrigante. Di solito, quando si registra la corrente da una piccola patch di membrana contenente un singolo canale ionico, si osservano fluttuazioni tra due ampiezze di corrente: una che rappresenta il canale chiuso e l’altra che rappresenta la corrente che scorre attraverso il canale aperto. Le fluttuazioni riflettono le transizioni tra stati cinetici aperti e chiusi. Con CLC-0, tuttavia, era evidente che la singola proteina del canale ionico consisteva di due pori equivalenti che potevano aprirsi indipendentemente1. Questo canale è stato quindi descritto come a doppia canna (Figura 2). Non fu quindi una grande sorpresa che le strutture dei cristalli degli omologhi dei batteri enterici rivelarono che il complesso proteico era un dimero, con ogni subunità che possedeva un percorso di conduzione degli ioni2 (Figura 2).

La seconda sorpresa sorse quando furono condotti esperimenti funzionali dettagliati su CLC-ec1 di E. coli. Piuttosto che funzionare come un canale del cloruro, come il suo parente a lungo perso nel muscolo scheletrico dei vertebrati, CLC-ec1 è un trasportatore di scambio 2Cl-/H+, o antiporter, con una stretta stechiometria di scambio 2:13. Questa proteina è importante per la sopravvivenza dei batteri enterici a basso pH4 ed è probabile che sfrutti un gradiente di cloruro per mantenere il pH cellulare a un livello tollerabile. Le CLC procariotiche potrebbero quindi essere bersaglio di inibitori per il trattamento di infezioni patogene da E. coli o Salmonella4. La scoperta del comportamento di scambio ionico ha naturalmente stimolato ulteriori sforzi per determinare se questo scambio cloruro-per-protone esistesse nelle CLC dei mammiferi, partendo dal presupposto che lo scambio Cl-/H+ potrebbe essere la vera funzione delle CLC archetipiche e quelle identificate come canali cloruro potrebbero essere solo eccezioni alla regola. Questo sembra essere il caso in quanto vi è una forte evidenza che CLC-3 attraverso a CLC-7 funzione come 2Cl-/H+ trasportatori di scambio, principalmente residente in organelli intracellulari, mentre CLC-1, CLC-2, KA e KB sono veri canali ionici cloruro-conduttori di membrana del plasma 5-9. Poiché la proprietà archetipica CLC è il trasporto di scambio, trovandosi in tutte le forme di vita cellulare, l’ultima sottoclasse di proteine, i canali cloruro bona fide, può quindi essere considerato ‘rotto’ trasportatori cloruro, che hanno perso l’accoppiamento del trasporto di cloruro al movimento di un secondo ione substrato.

CLC-1

Questo capostipite della famiglia CLC è il canale del cloruro voltaggio-gated del muscolo scheletrico e serve a regolare il potenziale di membrana e a ripolarizzare la membrana dopo potenziali d’azione per rilassare il muscolo. Nella maggior parte dei tessuti, ci aspetteremmo che i canali del potassio svolgano questo ruolo, come fanno nel muscolo cardiaco e liscio, oltre a regolare l’eccitabilità di membrana in altri tipi di cellule. Il sistema di tubuli trasversali è un’estensione della membrana plasmatica (sarcolemma) e penetra nel tessuto contrattile. È fondamentale per la rapida diffusione dell’attività elettrica in tutto il muscolo e orchestra una contrazione rapida e controllata. L’efflusso di potassio dalle cellule muscolari nello spazio confinato del t-tubulo aumenterebbe la concentrazione extracellulare di potassio e farebbe crollare questo gradiente ionico, il che porterebbe a una depolarizzazione prolungata della membrana. Con i canali del cloruro che svolgono il ruolo predominante di ripolarizzazione, questo viene impedito. Mutazioni di perdita di funzione in CLC-1 portano alla miotonia nell’uomo, nelle capre e nei topi (per una recente revisione vedi10) ed è caratterizzata da un compromesso rilassamento muscolare, coerente con la perdita di una corrente di membrana ripolarizzante.

Con espressione limitata al muscolo scheletrico, CLC-1 potrebbe essere un bersaglio attraente per farmaci che controllano la contrazione muscolare aumentando o diminuendo la funzione CLC-1 e quindi ridurre o aumentare l’eccitabilità muscolare, rispettivamente. I composti che aumentano la funzione di CLC-1 potrebbero essere in grado di trattare la miotonia, in particolare nei casi in cui potrebbero compensare la perdita parziale dell’attività del canale del cloruro. L’inibizione di CLC-1 potrebbe ridurre la soglia della contrazione muscolare e potrebbe essere utile nei casi di debolezza muscolare o di malattie degenerative come la distrofia muscolare.

CLC-2

Il canale del cloruro rettificante verso l’interno, CLC-2, ha una distribuzione dei tessuti piuttosto diffusa. Si trova nei neuroni centrali dove regola l’attività neuronale11-13. Negli astrociti, il suo targeting subcellulare alle giunzioni cellulari è regolato da un’interazione con GlialCAM (MLC1), le cui mutazioni interrompono questo targeting e causano la leucoencefalopatia megalencefalica14. Recenti interessi terapeutici coinvolgono l’espressione di CLC-2 nella mucosa intestinale e nei bronchioli polmonari dove svolge un ruolo nelle secrezioni intestinali e polmonari, rispettivamente. Lubiprostone, un farmaco usato clinicamente per alleviare la stitichezza, è stato proposto per esercitare il suo effetto attivando CLC-2, ma questo effetto è controverso. Mentre questo composto attiva i canali CLC-2 in alcuni studi, in altri regola il traffico di CLC-2 e aumenta la funzione CFTR attraverso l’attivazione del recettore della prostaglandina15,16. Tuttavia, rimangono prove sufficienti che l’aumento della funzione CLC-2 delle vie aeree potrebbe fornire un percorso alternativo del cloruro nella fibrosi cistica17.

CLC-KA/KB

Questi canali del cloruro sono notevolmente espressi negli epiteli renali e contribuiscono alla permeabilità delle membrane cellulari al flusso passivo di cloruro. Hanno un ruolo chiave nell’arto ascendente e nei tubuli distali del nefrone, fornendo una via basolaterale per il riassorbimento del cloruro, dopo il trasporto dall’urina primaria attraverso la membrana apicale. Il gene CLCKB, che codifica CLC-KB, è uno dei cinque geni alla base della sindrome di Bartter. Le mutazioni di perdita di funzione in CLC-KB provocano un riassorbimento difettoso del cloruro e quindi portano a un disordine di spreco di sale, che è associato alla poliuria. Una delle caratteristiche principali degli individui affetti da mutazioni CLC-KB (tipo III di Bartter) è la pressione bassa. Una forma più grave della malattia è causata da mutazioni nel gene BSND (tipo IV di Bartter), che codifica Barttin, una proteina accessoria importante per il traffico di CLC-KA e KB verso la membrana plasmatica18. Questa forma del disordine include anche la sordità sensoriale, che si pensa sia causata dalla perdita del traffico sia di CLC-KA che di KB verso le membrane epiteliali dell’orecchio interno. Presumibilmente, la perdita di attività CLC-KA o KB, ma non entrambe, può essere tollerata dal sistema uditivo. Questo suggerisce che gli inibitori selettivi per CLC-KA o CLC-KB, o l’inibizione parziale di entrambi, possono agire come un nuovo diuretico dell’ansa con il potenziale di abbassare la pressione sanguigna e con pochi effetti collaterali. Questo ha portato allo studio della loro farmacologia e allo sviluppo di nuovi derivati inibitori con bassa affinità micromolare19, che hanno avuto effetti diuretici quando somministrati ai ratti20. D’altra parte, i farmaci che attivano i canali CLC-KB possono migliorare l’attività residua dei canali difettosi nei pazienti con Bartter di tipo III.

CLC-7

Della sottoclasse dei trasportatori di scambio 2Cl-/H+, CLC-7 è un bersaglio promettente per l’azione dei farmaci e la sua inibizione può essere utile nell’osteoporosi. Ancora una volta, questa indicazione trae origine dalle osservazioni della malattia umana causata da mutazioni loss-of-function in CLC-7, che causano osteropetrosi21. In questo disordine, il rimodellamento dell’osso da parte degli osteoclasti è carente, il che si pensa sia causato da una difettosa secrezione di acidi ed enzimi. Questo porta ad un osso denso, che se riprodotto da un inibitore di CLC-7 potrebbe ridurre la dissoluzione dell’osso e quindi rafforzare lo scheletro dei pazienti con osteoporosi22,23. In studi di proof-of-concept, l’inibizione farmacologica dell’acidificazione24 o l’interruzione della funzione di CLC-7 mediante anticorpi25 hanno ridotto il riassorbimento osseo. Tuttavia, l’inibizione di CLC-7 potrebbe non essere priva di complicazioni perché studi sull’uomo e sul topo suggeriscono che la mancanza di funzione di CLC-7 può anche essere associata a disturbi di stoccaggio e degenerazione neuronale a causa della ridotta funzione lisosomiale26.

Mutazioni umane senza funzione – lezioni da CFTR

A questo punto vale la pena fare una breve pausa per considerare che alcune delle indicazioni terapeutiche per i nuovi farmaci mirati alla CLC mirano a trattare disturbi distinti e all’estremità opposta dello spettro di quelli che sono causati da una funzione difettosa della CLC. Oltre a quelli descritti sopra, la malattia di Dent I è una malattia renale X-linked causata dalla perdita della funzione di CLC-5 (vedi27 per una recente revisione). Tutti sono rari disordini ereditari e il principale difetto della proteina comporta una ridotta attività della proteina o il traffico verso la membrana bersaglio. Infatti, molte mutazioni individuali causano una ritenzione ER e una mancanza di maturazione della proteina. Un parallelo potrebbe essere fatto con la fibrosi cistica, con la maggior parte degli individui affetti che possiedono la mutazione ΔF508 trattenuta dall’ER. Gli approcci recenti e stratificati al trattamento della fibrosi cistica sono stati il risultato di un duplice attacco per correggere il ripiegamento della proteina mutante (correttori CF) e/o aumentare l’attività dei canali del cloruro della membrana plasmatica CFTR (potenziatori CF). Il successo sta emergendo con la classe dei potenziatori28, che sono efficaci nei pazienti con mutazioni che riducono l’attività della CFTR senza perdita della biosintesi o del traffico della proteina (ad esempio G551D), tuttavia l’efficacia dei correttori del ripiegamento (che è richiesta nella maggior parte dei casi) rimane da stabilire29. Sebbene le malattie associate alla perdita della funzione CLC siano tutti rari disordini genetici, un giorno potremmo essere in grado di trattare individui con miotonia, sindrome di Bartter, malattia di Dent e osteopetrosi, così come la fibrosi cistica con farmaci che correggono la causa effettiva del loro disturbo.

Canali del cloruro attivati dal calcio

Infine, si parlerà dei canali del cloruro attivati dal calcio (ClCa), che hanno ruoli fisiologici chiaramente definiti in diversi tipi di cellule, ma la loro identificazione molecolare ha subito alcune partenze false e balbettate. La storia coinvolge quattro tipi di proteine: membri delle famiglie di geni CLCA, Bestrophin, Tweety e TMEM16. In tutti i casi, la loro sovraespressione ricombinante ha portato alla generazione di correnti di cloruro di membrana che sono stimolate dall’aumento della concentrazione di calcio intracellulare e, in varia misura, dalla depolarizzazione della membrana. Il viaggio per CLCA si è concluso quando si è scoperto che si trattava di una proteina secreta, ma che probabilmente upregolava anche l’espressione di membrana dei canali ClCa endogeni al sistema di espressione30. Le proteine Tweety e Bestrophin non mostrano tutte le proprietà dei canali ClCa studiati nei principali tessuti, anche se Best1 sembra responsabile di una componente del ClCa nei neuroni sensoriali31 e può anche essere un importante regolatore del rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico32,33. Tre studi indipendenti hanno proposto TMEM16A (chiamato anche Ano1) come candidato per un componente principale, se non nella sua interezza, di un canale del cloruro attivato dal calcio34-36. Molti studi successivi, facilitati dalla generazione di strumenti molecolari, hanno sostenuto questo. TMEM16A è importante per regolare l’eccitabilità di membrana nel muscolo liscio vascolare, è upregolato in un modello animale di ipertensione polmonare e il tono può essere ridotto dall’inibizione del canale37,38. Nei neuroni sensoriali, TMEM16A accoppia la presenza di mediatori infiammatori all’ipereccitabilità di membrana e l’inibizione di TMEM16A ha effetti antinocicettivi39. Nei modelli animali di asma, l’espressione di questo particolare canale del cloruro è aumentata e la sua inibizione può avere effetti benefici40. Si trova anche nelle cellule interstiziali di Cajal dell’intestino e la funzione del canale è richiesta per la contrazione ritmica della muscolatura liscia nella parete intestinale41. Inoltre, l’attivazione di TMEM16A può fornire una via alternativa per la secrezione epiteliale di cloruro nella fibrosi cistica42. Mentre c’è ancora qualche dibattito sulla funzione precisa del resto della famiglia TMEM16, la funzione ClCa è stata attribuita anche a TMEM16B (Ano2), che si pensa sia alla base del canale ClCa nelle cellule ciliate olfattive43,44. Ci possono essere anche ruoli per questa classe di canali ionici nella biologia delle cellule tumorali e la sua inibizione può prevenire la proliferazione cellulare45-48.

Raccomandazioni conclusive

Questa revisione ha evidenziato i diversi ruoli delle proteine conduttrici o trasportatrici di cloruro e come la loro disfunzione è accoppiata a disturbi umani o a sintomi simili alla malattia in modelli animali. C’è una grave mancanza di reagenti farmacologici che inibiscono, attivano o migliorano il traffico di membrana dei canali del cloruro e dei trasportatori. Si stanno facendo progressi con i farmaci che invertono la funzione difettosa di CFTR nella fibrosi cistica, che si spera possano portare a farmaci specifici per i diversi tipi di mutazione ereditata. Gli inibitori e gli attivatori dei canali del cloruro attivati dal calcio TMEM16A42,49 si stanno dimostrando utili strumenti di laboratorio e i nuovi composti potrebbero diventare farmaci efficaci, in particolare se possono fornire effetti specifici per i tessuti. Le molecole specifiche per particolari CLC sono probabilmente le più sfuggenti. Comprendere la base strutturale dell’attivazione delle CLC voltaggio-gate50 potrebbe identificare i domini proteici che possono essere presi di mira dalla progettazione razionale di farmaci basati sulla struttura. Tali strumenti ci permetteranno di mettere alla prova alcune delle nuove idee terapeutiche che sono state esaminate e presentate qui.

Biografia dell’autore

Il dottor Jon Lippiat ha completato il suo dottorato sulla struttura, funzione e farmacologia dei canali del potassio all’Università di Leicester. Ha studiato la funzione delle beta-cellule pancreatiche e il diabete all’Università di Oxford prima della sua nomina a docente di farmacologia all’Università di Leeds. La sua ricerca consiste nel chiarire le proprietà strutturali e fisiologiche di diversi tipi di canali ionici e trasportatori e il loro potenziale bersaglio con nuovi reagenti farmacologici.