Le cellule cromaffine formano forse il sistema cellulare più interessante del corpo umano. Sono strettamente legate ai neuroni simpatici e sono uno dei derivati della cresta neurale più studiati. Essendo un ibrido evolutivo del sistema endocrino e nervoso, sono serviti come modello per esplorare i meccanismi di base della neurofisiologia, della secrezione regolata e della farmacologia. Così, le cellule cromaffini surrenali possono essere considerate come il cervello periferico in quanto condividono con i neuroni alcuni meccanismi fondamentali: (1) ricevono input di natura elettrica e chimica; (2) sono in grado di decodificare e riconoscere questi segnali; (3) possiedono il macchinario per generare ed elaborare pattern di risposte come il rilascio di catecolamine e altri messaggeri. In conclusione, le cellule cromaffini, come un neurone, possono essere viste come una cellula secretoria che rilascia la sua secrezione a grande distanza dal corpo cellulare dove le macromolecole sono sintetizzate, forniscono una rapida comunicazione tra parti ampiamente separate del corpo. Inoltre, il midollo surrenale con le sue cellule cromaffini serve attraverso il rilascio di catecolamine per la comunicazione con tutti gli organi più importanti come il cuore, l’apparato vascolare, i polmoni, il rene e anche il cervello.
Più importante, le cellule cromaffini situate nel centro di un organo periferico facilmente accessibile sono servite per molti anni come finestra sulle funzioni del cervello. Le cellule cromaffini sono servite come modello per identificare il concetto di base della trasmissione neurochimica. I primi organelli secretori sono stati isolati dalle cellule cromaffini, e le vescicole cromaffine sono servite come modello di vescicola contenente neurotrasmettitore. Molte delle principali proteine associate alle vescicole coinvolte nel processo di esocitosi sono state caratterizzate nelle vescicole cromaffini.1, 2, 3, 4, 5
Condividendo la stessa origine ectodermica (cresta neurale), le cellule cromaffini fanno parte del cosiddetto triangolo di Erspamer (pelle, intestino e cervello), che possiede gli stessi neurotrasmettitori, neuropeptidi, meccanismi di trasduzione.6 Gran parte della comprensione odierna della fisiologia e della fisiopatologia dei sistemi di neurotrasmettitori neuropeptidici e monoaminici si deve a studi che utilizzano sistemi modello di cellule cromaffini. La linea cellulare del feocromocitoma di ratto (PC12) sviluppata da Greene e Tischler7 oltre 35 anni fa rimane una delle più studiate e continua a fornire un potente modello per la comprensione dei sistemi neuronali. Questa linea cellulare e altri sistemi modello cromaffina sono stati particolarmente utili per gli studi dei meccanismi esocitici, compreso il funzionamento dei canali ionici, la dinamica vescicolare e l’accoppiamento stimolo-secrezione. I progressi metodologici associati in elettrofisiologia, dallo sviluppo del patch clamp a tecniche più sofisticate che combinano metodi elettrofisiologici ed elettrochimici (per esempio, patch amperometria) sono stati ampiamente facilitati dalla disponibilità di tali sistemi modello.
Nella ghiandola surrenale del gatto perfusa in situ è stato chiaramente dimostrato, utilizzando diversi stimoli recettoriali (acetilcolina, nicotina, dimetilfenilpiperazimio e così via) che le cellule cromaffine possiedono due granuli neurosecretori distinti (quelli noradrenergici e quelli adrenergici), escludendo così l’idea che quelle noradrenergiche fossero le cellule precursori in cui la feniletanolamina-N-metiltransferasi funziona per trasformarle in cellule cromaffini adrenergiche. Inoltre, anche a livello cerebrale la D-anfetamina aumenta particolarmente il rilascio di noradrenalina.8, 9
Oltre a migliorare la comprensione dei processi di sviluppo neurale, i sistemi di cellule cromaffine sono stati estremamente importanti per gli studi sui processi neurodegenerativi, la tumorigenesi e lo sviluppo di farmaci.
Inoltre, a causa della stretta relazione delle cellule cromaffine con i neuroni catecolaminergici, sono state utilizzate persino per il trattamento di disturbi neurodegenerativi del cervello come il morbo di Parkinson.10 Tra il 1988 e il 2001, >300 pazienti parkinsoniani sono stati trattati con trapianti surrenali autologhi con qualche miglioramento dei sintomi clinici. Tuttavia, i tassi di sopravvivenza delle cellule cromaffini adulte trapiantate erano solo a breve termine e i miglioramenti clinici scomparivano 1-2 anni dopo il trapianto.11, 12 Una grave limitazione nell’applicazione del midollo surrenale adulto era probabilmente la natura post-mitotica della maggior parte delle cellule trapiantate.
Al tempo stesso, gli endocrinologi hanno esplorato il ruolo di diversi ormoni centrali di rilascio e neuropeptidi all’interno dei sistemi delle cellule cromaffini.13 È interessante notare che il midollo surrenale in periferia esprime una serie simile di neuropeptidi che si verificano nel cervello coinvolti nella regolazione dello stress, omeostasi energetica, ansia e dolore.14, 15 Il concetto di produzione ectopica di ormoni è stato tra l’altro descritto e perfezionato in queste cellule. Questo include l’espressione dell’ormone di rilascio della corticotropina, adrenocorticotropina, pro-opiomelanocortina e altri neuropeptidi nel midollo surrenale. L’intenso crosstalk delle cellule endocrine, le vie paracrine e neurocrine della comunicazione endocrina, sono state stabilite in particolare nella ghiandola surrenale.16 Anche qui, il microambiente complesso ma accessibile del surrene imita il microambiente del cervello per quanto riguarda il crosstalk delle strutture neuronali con diversi tipi di cellule endocrine.17 Inoltre, l’azione degli steroidi e dei neurosteroidi che si verificano nel cervello è stata ampiamente studiata nei sistemi di cellule cromaffini.18, 19 La stretta interazione tra la parte corticale e quella midollare della ghiandola surrenale è stata dimostrata da tempo. Infatti, l’inibizione della biosintesi dei glucocorticoidi surrenali da parte dell’inibitore specifico aminoglutetimide ha determinato sia nei gatti che nei ratti una significativa diminuzione delle catecolamine a livello midollare senza cambiamenti tra i due tipi di cellule cromaffini. Pertanto, i glucocorticoidi esercitano un ruolo permissivo sul sistema cromaffini attraverso un doppio meccanismo, uno diretto alle cellule cromaffini e uno indiretto attraverso l’inibizione del rilascio di CRH a livello ipotalamico.20, 21
Se il sistema periferico di ossido nitrico è presente nella corteccia surrenale, le cellule cromaffini esprimono il sistema di ossido nitrico del cervello. Così, i meccanismi di base della regolazione dell’ossido nitrico sia per i neuroni che per le cellule endocrine sono stati identificati nelle cellule cromaffini.22 Allo stesso modo, l’ipofisi e il midollo surrenale contengono la più alta quantità di vitamina C nel corpo umano, e i meccanismi del ruolo dell’assorbimento della vitamina C e della regolazione dei neurotrasmettitori sono stati identificati nelle cellule cromaffini.23
L’ampio ruolo del fattore di crescita nervosa (NGF) nell’organismo vivente è stato scoperto per la prima volta nel midollo surrenale.24 Infatti, Unsicker et al.25 all’epoca presso la Johns Hopkins University hanno scoperto che le cellule cromaffini immature ottenute dal midollo surrenale coltivate in presenza di NGF acquisiscono le proprietà biochimiche e morfologiche dei neuroni simpatici.
Inoltre, gli esperimenti condotti nel laboratorio di biologia cellulare del CNR di Roma da Aloe e Levi-Montalcini26 hanno dimostrato in vivo che l’applicazione di NGF nel feto di ratto e continuata per 3 settimane dopo la nascita induce la differenziazione delle cellule cromaffini in neuroni simpatici all’interno della ghiandola surrenale. Questo stabilì chiaramente che l’NGF aveva un ruolo molto più ampio negli organismi viventi di quanto fosse stato supposto fino ad allora.
Il midollo centrale aumentò notevolmente di volume come risultato della differenziazione delle cellule surrenali in neuroni simpatici, che germogliano un gran numero di fibre ampiamente ramificate.
Dato il ruolo eccezionale che il sistema delle cellule cromaffine ha avuto in passato, sarebbe un errore non utilizzare il sistema per le questioni attuali della ricerca sul cervello.
Siamo entrati in una nuova era della medicina rigenerativa anche per le malattie neurodegenerative del cervello. Le cellule cromaffini potrebbero ancora una volta prendere l’iniziativa per esplorare alcuni dei meccanismi di rigenerazione che riguardano in modo simile i disturbi più complessi del sistema nervoso centrale (SNC). Linee di cellule cromaffini sono ora utilizzate per esplorare il ruolo del NGF nella malattia di Alzheimer. Infatti, le proteine dei granuli cromaffini promuovono la sopravvivenza dei neuroni,27 il che può essere dovuto a una serie di fattori neurotrofici noti o ancora sconosciuti. Così, la privazione di NGF da cellule PC12 differenziate ha causato una sovrapproduzione di peptidi amiloidi-β, che sono i frammenti proteici più tossici direttamente implicati nello sviluppo della malattia di Alzheimer, in concomitanza con la morte cellulare per apoptosi.28 La stretta connessione tra privazione di NGF e attivazione della via amiloidogenica è stata estesa ai neuroni ippocampali.29 Questi studi hanno rivelato una nuova proprietà di TrkA, il recettore NGF ad alta affinità. Quando viene privato di NGF, TrakA passa da un sistema di segnalazione cellulare prosurvival a uno proapoptotico. È ragionevole ipotizzare che tale proprietà sia operativa anche nei neuroni cromaffini che recano il recettore di NGF e che sia alla base di nuove vie per i meccanismi di segnalazione cellulare in queste cellule.29
NGF promuove anche la sopravvivenza cellulare durante lo stress da reticolo endoplasmatico nelle cellule PC12.30 Inoltre, le cellule PC12 sono ora ampiamente utilizzate per studiare l’effetto e le vie di segnalazione di numerosi altri peptidi neurotrofici e neuroprotettivi nella rigenerazione del cervello. Questo include il polipeptide attivante l’adenilato ciclasi pituitaria,31, 32 la proteina morfogenetica ossea 733 e il fattore neurotrofico dopamina cerebrale,34 che può ripristinare i neuroni dopaminergici nelle malattie degenerative del cervello come il morbo di Parkinson. Le variazioni di sequenza nel gene BDNF sono state associate alla depressione maggiore e al successo del trattamento antidepressivo,35 e il ruolo del BDNF nel mediare il ruolo neuroprotettivo degli antidepressivi è stato recentemente esplorato in linee cellulari cromaffini.36
Inoltre, sempre più prove suggeriscono l’esistenza di cellule progenitrici multipotenti derivate dalla cresta neurale nel midollo surrenale adulto.37 La loro recente identificazione e isolamento38 accende nuove speranze per il loro potenziale uso nel trattamento rigenerativo delle malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson.39, 40, 41 Le cellule progenitrici cromaffini condividono proprietà significative con le cellule staminali neurali. Simili alle neurosfere, quando viene impedita l’aderenza al piatto di coltura, le cellule progenitrici cromaffini crescono in sfere con capacità di autorinnovamento, che abbiamo chiamato cromosfere. Esprimono i marcatori di progenitori neurali nestina, vimentina, musashi 1 e recettore NGF, così come Sox1 e Sox10,38 Mash137 e proteine del percorso Notch (Vukicevic e colleghi, in revisione). Inoltre, sono in grado di differenziarsi in neuroni catecolaminergici maturi38 (Vukicevic e colleghi, in revisione). Simile al differenziamento delle cellule staminali neurali, dove Notch è un regolatore chiave del mantenimento delle cellule staminali neurali nel sistema nervoso in via di sviluppo,42, 43 lo spostamento verso la differenziazione neuronale delle cellule della cromosfera è accompagnato da una riduzione dei marcatori dei progenitori neurali tra cui Notch-2, Hes (peloso e potenziatore della scissione) 1, Hes 5 e nestin (Vukicevic e colleghi, in revisione).
Infine, non bisogna dimenticare che le cellule enterocromaffini derivano anche dalla cresta neurale, e rappresentano il sito in cui Vittorio Erspamer scoprì nel 1930 l’enteramina,44 che in seguito fu trovata identica alla serotonina (5-HT)45 presente nel SNC.46 Esiste in letteratura un gran numero di lavori che dimostrano che altri neurotrasmettitori, neuropeptidi e gli stessi meccanismi di trasduzione presenti nel cervello esistono anche nelle cellule cromaffini gastrointestinali dove hanno ruoli importanti.47
Quindi, le cellule cromaffini e i neuroni cerebrali e i loro precursori condividono vie di segnalazione simili e costituiscono di nuovo un modello ideale per identificare le vie innate e i bersagli della rigenerazione cerebrale.
I recenti sforzi per sondare il potenziale endogeno di rigenerazione e riparazione del SNC adulto si scontrano con grandi difficoltà, che si basano sulla rigidità del sistema e sul limitato accesso ai farmaci. La barriera emato-encefalica limita il numero di fattori che possono essere testati sistematicamente e richiede alternative invasive come le iniezioni dirette nel cervello. La rigidità deriva dalla sottile plasticità esibita, forse come mezzo per preservare l’omeostasi e la memoria. La ghiandola surrenale, in netto contrasto, è un organo notevolmente plastico che reagisce in modo marcato a molti stress fisici ed emotivi. Per lo scienziato che ricerca il cambiamento di stato, la ghiandola surrenale è uno strumento eccezionale. Al suo interno, il canarino nella miniera di carbone è la cellula cromaffina e il suo precursore. Gli insulti fisici ed emotivi alterano la funzione, le proprietà e il numero di queste cellule in un modo che è facile da valutare e manipolare. La rilevanza per le neuroscienze è diretta: i precursori delle cellule cromaffine condividono molte caratteristiche comuni con i loro fratelli in buona fede del SNC; possono essere coltivati in modo molto simile (Figura 1), esprimono molti marcatori comuni, compresi i componenti del citoscheletro e i fattori di trascrizione e, criticamente, rispondono a molti trattamenti in modo simile. Come sistema di ricerca per il neuroscienziato, la ghiandola surrenale è un modello del cervello, al di fuori della barriera emato-encefalica, che mostra reazioni aumentate. Al suo interno, le cellule precursori della cromaffina sono una finestra accessibile e misurabile per il funzionamento delle cellule staminali neurali del SNC. In un momento in cui gli scienziati si sforzano di non chiudersi in un solo organo, ma di cercare indizi che portino a nuovi approcci terapeutici nel maggior numero possibile di luoghi, il sistema delle cellule cromaffini è un compagno di ricerca eccezionale per la sua controparte più esoterica del SNC.
Le cellule precursori cromaffini adulte si comportano in modo simile alle cellule staminali neurali adulte. Più di un secolo fa, Kohn ha dimostrato le somiglianze tra le cellule cromaffini e i neuroni.53, 54, 55 Di conseguenza, le cellule cromaffini isolate e la linea cellulare PC12, derivata da un feocromocitoma del midollo surrenale di ratto, sono state stabilite come modelli di differenziazione neuronale. I recenti progressi nella biologia delle cellule staminali hanno generato metodi di coltura che permettono la propagazione di cellule precursori primarie da tessuti non cancerosi. Queste tecniche hanno ampliato le somiglianze tra le cellule cromaffini adulte mature e i neuroni adulti maturi alle loro cellule precursori di origine: ora si comprende sempre più che i precursori delle cellule cromaffine si comportano in modo simile alle cellule staminali neurali del SNC. (a) Le cellule staminali neurali del cervello fetale e adulto e i precursori cromaffini del midollo surrenale bovino adulto possono essere coltivati senza attaccamento delle cellule al substrato, dando origine a strutture sferoidali (3-dimensionali). (b) Come le loro controparti del SNC, i precursori del midollo surrenale bovino adulto possono anche essere coltivati come monostrati in assenza di siero, con il supporto mitogenico del fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF). Ritiro di bFGF dal mezzo di coltura induce la differenziazione di queste cellule entro 2 giorni. (Inserto: colture monostrato di cellule staminali neurali in presenza di bFGF per un confronto morfologico).
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Nel SNC, un ruolo delle cellule staminali neurali endogene (eNSC) nella generazione di nuovi neuroni è riconosciuto solo in due aree, la zona subventricolare e il giro dentato dell’ippocampo. Tuttavia, popolazioni di eNSC sono state scoperte in tutto il cervello e il midollo spinale di roditori e primati adulti. Una popolazione diffusa può essere identificata utilizzando l’espressione del fattore di trascrizione Hes3.48 Tali osservazioni hanno sollevato ruoli per le eNSC diversi dalla sostituzione cellulare. Hes3 è regolato da un ramo non canonico della via di Notch che comporta l’attivazione sequenziale del recettore Notch, la fosforilazione della molecola di segnalazione trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 sul suo residuo di serina e l’induzione della trascrizione di Hes3.49 Anche altri fattori che regolano questa via in diversi punti, tra cui l’insulina,50 gli inibitori delle chinasi p38MAP e Janus, l’angiopoietina 2 ligando del recettore Tie2 e la tossina del colera51 aumentano il numero di cellule staminali. Individualmente, alcuni di questi fattori hanno effetti negativi sulla vascolarizzazione (alcuni sono pro- e altri anti-angiogenici).52 Quando sono combinati in una particolare miscela contenente Delta4, angiopoietina2, insulina e un inibitore della Janus kinasi, si ottiene il massimo aumento del numero di eNSC con minimi effetti collaterali vascolari. Nei ratti sottoposti a parkinsonismo sperimentale, una singola iniezione di questa miscela promuove il salvataggio a lungo termine dei neuroni della dopamina, che altrimenti morirebbero, e il recupero delle abilità motorie. Questi risultati suggeriscono che le eNSC hanno un ruolo nel proteggere i neuroni compromessi. Molti di questi componenti del percorso possono essere condivisi con il sistema delle cellule cromaffine e il lavoro ha già dimostrato un coinvolgimento generale del recettore Notch e diversi fattori di trascrizione comuni (vedi sopra). Inoltre, l’ambiente altamente vascolarizzato della ghiandola surrenale suggerisce che le citochine angiogeniche possono regolare anche le cellule precursori adrenomedullari. Anche se il coinvolgimento delle cellule precursori cromaffini nel rifornimento cellulare nel midollo surrenale è stabilito, i dati dal SNC suggeriscono che ulteriori ruoli di regolazione e possibilmente pro-sopravvivenza delle cellule cromaffini nel midollo surrenale attendono la scoperta.
In sintesi, le lezioni che abbiamo imparato dalla biologia delle cellule cromaffini come modello periferico per il cervello e le malattie del cervello riguardano più che mai la ricerca all’avanguardia in neurobiologia. Dovremmo continuare e intensificare l’uso di questo modello per svelare i meccanismi di rigenerazione sia nel SNC che nel tessuto neuroendocrino. Non solo aiuterà a esplorare i meccanismi di base del rinnovamento e della rigenerazione cellulare, ma anche a progettare nuove strategie per le terapie rigenerative del cervello in futuro.