Stai cercando di iniziare ad usare campioni di sangue nella tua ricerca traslazionale? Forse sei interessato al cancro al seno metastatico o al polmone non a piccole cellule. O forse le sfide e le limitazioni dei campioni di tumori solidi ti hanno fatto pensare… è arrivato il momento.
E adesso?
Diamo uno sguardo più da vicino alla resa del DNA e alla realtà di lavorare con il DNA privo di cellule dal plasma. Il DNA privo di cellule (o cfDNA) si riferisce a tutto il DNA non incapsulato nel flusso sanguigno. Una parte di questo DNA privo di cellule proviene da un clone tumorale ed è chiamato DNA tumorale circolante (o ctDNA). Il cfDNA sono frammenti di acido nucleico che entrano nel flusso sanguigno durante l’apoptosi o la necrosi. Normalmente, questi frammenti vengono ripuliti dai macrofagi, ma noi crediamo che la sovrapproduzione di cellule nel cancro lasci più cfDNA. Questi frammenti hanno una lunghezza media di circa 170 basi, hanno un’emivita di circa due ore e sono presenti sia nella fase iniziale che in quella finale della malattia in molti tumori comuni, tra cui il polmone non a piccole cellule e il seno. Detto questo, la concentrazione di cfDNA varia notevolmente, verificandosi tra 1 e 100.000 frammenti per millilitro di plasma.
Se sei stato nello spazio del sequenziamento di nuova generazione per un po’, potresti voler sapere di sensibilità e specificità. Abbiamo dimostrato alta sensibilità e specificità per le varianti a frequenza superiore al punto uno per cento con 20 nanogrammi di DNA in ingresso, e superiore al punto cinque per cento con 5 nanogrammi . Per saperne di più su come fare, guarda il nostro video sui test cfDNA. Potresti aver sentito parlare dell’utilizzo del cfDNA per analisi al limite di rilevamento del punto zero uno per cento. Mentre la tecnologia esiste per raggiungere il .01% (goccia digitale per esempio), c’è un limite biologico di cui dobbiamo parlare.
Da un campione di sangue di 10 mL, utilizzando il kit di isolamento del DNA libero da cellule MagMAX di Applied Biosystems, otteniamo abitualmente circa 20 nanogrammi di cfDNA, o circa 6 molecole utilizzabili per l’analisi. Qualche rapido calcolo ci mostra che al limite di rilevazione dell’1%, possiamo aspettarci circa 25 molecole. Allo 0,1% ci si aspetta che siano presenti solo 2-3 molecole. Ciò significa che al di sotto dello 0,1% potrebbe non essere presente alcuna molecola da analizzare. Ricordate anche che le concentrazioni di cfDNA sono altamente variabili. Possono essere molto basse in fasi critiche come la recidiva precoce o lo sviluppo della resistenza, dove molti ricercatori sono ora concentrati. Per isolare con successo 20 nanogrammi di DNA dal plasma sanguigno, sono disponibili sia metodi manuali che automatizzati a seconda delle vostre esigenze di produttività.
DNA in mano, la vostra ricerca detta quale strada prendere a questo punto. Potresti scegliere la PCR digitale per gli studi di monitoraggio delle recidive. Per la ricerca sulla selezione della terapia, potrebbe essere preferito un test di sequenziamento di prossima generazione. Ovunque vi porti la vostra ricerca sulla biopsia liquida, possiamo aiutarvi ad arrivarci con soluzioni complete per l’analisi del cfDNA, da pochi obiettivi a saggi multi-gene.
Spero che vi abbiamo dato alcune cose a cui pensare mentre considerate l’uso del DNA privo di cellule nel vostro laboratorio. Ma sono sicuro che avrete delle domande. Quindi inviate le vostre domande su thermofisher.com/ask e iscrivetevi al nostro canale per vedere altri video come questo. E ricordate, quando siete in dubbio, fate il Seq It Out!