La Chimera era una creatura della mitologia greca rappresentata solitamente come un composto di leone, capra e serpente. L’uso contemporaneo del termine “chimerismo” nel trapianto di cellule ematopoietiche deriva da questa idea di un’entità “mista”, riferendosi a qualcuno che ha ricevuto un trapianto di tessuto geneticamente diverso. Un test per il chimerismo dopo un trapianto di cellule staminali ematopoietiche comporta l’identificazione dei profili genetici del ricevente e del donatore e quindi la valutazione del grado di mescolanza nel sangue, nel midollo osseo o in altri tessuti del ricevente.
Il test del chimerismo (analisi dell’incisione) tramite DNA impiega la metodologia comunemente usata nei test di identità umana ed è realizzato tramite l’analisi dei polimorfismi genomici chiamati loci a ripetizione tandem breve (STR). Questi loci consistono in una sequenza centrale di DNA che viene ripetuta un numero variabile di volte all’interno di un locus genetico discreto. Il termine STR, chiamato anche microsatelliti, si riferisce al numero di coppie di basi di una sequenza di DNA centrale ripetuta in tandem che varia da 2 a 8 coppie di basi in lunghezza. Questi loci presentano alleli che possono differire in lunghezza tra gli individui e sono ereditati come tratti mendeliani codominanti. I loci STR sono stati identificati in tutto il genoma umano e alcuni loci hanno più di 25 alleli.
Le informazioni sulla sequenza di DNA all’interno delle regioni laterali conservate dei loci vengono utilizzate per creare coppie di primer oligonucleotidici per gli STR. Questi primer vengono utilizzati nell’amplificazione PCR (reazione a catena della polimerasi) dei campioni di test. Questa tecnica può amplificare la sequenza STR fino a un miliardo di volte, fornendo materiale che può essere separato con un gel elettroforetico o tramite elettroforesi capillare (CE). La genotipizzazione viene effettuata valutando le dimensioni dei frammenti di DNA. Il riferimento a una scala allelica può essere utilizzato per l’identificazione esatta degli alleli STR.
Il sistema STR/CE basato sulla PCR presenta diversi vantaggi rispetto ad altri metodi di analisi. L’amplificazione di più loci STR può essere combinata (multiplexing) in una singola provetta, permettendo l’analisi di un massimo di sedici loci in una sola reazione. Poiché sono richieste quantità minime di DNA, è possibile utilizzare campioni con un basso numero di cellule e le piccole dimensioni degli alleli STR rendono possibile anche l’utilizzo di campioni di DNA degradati. I dati digitali facilitano l’analisi e l’archiviazione, e il processo CE è veloce e conveniente. L’amplificazione tramite PCR e l’analisi dei loci STR fornisce un metodo rapido e affidabile per la valutazione dello stato di incisione nell’ambito del trapianto di cellule staminali.
La tecnologia attualmente utilizzata consente la co-amplificazione e la rilevazione a tre colori di sedici loci che sono suddivisi in 3 serie di 5 o 6 loci che presentano frammenti amplificati con intervalli di dimensioni non sovrapposte.
Durante la fase di amplificazione tramite PCR, i frammenti amplificati sono contrassegnati con coloranti fluorescenti. Dopo l’amplificazione PCR, i campioni vengono elaborati su un sistema di elettroforesi capillare (CE).
L’analisi dei dati è facilitata da un software di analisi dei frammenti che dimensiona i frammenti di DNA usando una corsia interna standard eseguita con il campione e assegna i genotipi per confronto con una scala allele STR inclusa nella corsa CE. Ciò fornisce profili genotipici STR distinti per il donatore e per il ricevente del trapianto. I loci STR che sono polimorfici (cioè, informativi) tra questi individui sono usati per valutare le quantità relative di DNA del ricevente e del donatore nel campione post-trapianto.
I campioni analizzati possono provenire da qualsiasi materiale contenente DNA, compresi midollo osseo, sangue periferico, tumori solidi, tessuto epidermico, follicoli piliferi, tamponi buccali e sottoinsiemi cellulari frazionati. Poiché l’amplificazione PCR di un campione viene eseguita di routine con meno di 2 ng di DNA genomico (equivalente a circa 300 cellule), il test di chimerismo con questo metodo può essere eseguito con successo anche per i pazienti con fallimento del trapianto, leucopenia grave o da sottoinsiemi di cellule ematopoietiche. L’analisi STR è stata utilizzata per valutare lo stato di incisione dei pazienti che hanno ricevuto un trapianto di cellule ematopoietiche, compresi i pazienti che hanno ricevuto unità di sangue cordonale doppie o un secondo trapianto da un donatore diverso; così come per confermare l’identità genetica di gemelli putativi identici e per rilevare l’incisione di cellule materne derivate dall’utero tra i pazienti con una diagnosi di immunodeficienza combinata grave (SCID). L’analisi STR/CE è una procedura rapida, affidabile, accurata e riproducibile.
Limitazioni del test
- È necessario isolare una quantità sufficiente di DNA dai campioni per consentire una robusta amplificazione PCR. I metodi di isolamento del DNA devono essere disponibili per gestire campioni con un basso numero di cellule, come quelli che si possono incontrare nei riceventi con fallimento dell’innesto e dai sottoinsiemi di globuli bianchi selezionati con la citometria a flusso. I campioni possono avere concentrazioni troppo basse per essere quantificate dalla spettrofotometria UV OD260. I campioni di DNA da 5.000 a 30.000 cellule isolate forniscono in modo affidabile un’amplificazione accettabile. Il laboratorio ha delle linee guida che definiscono quando l’analisi del campione deve essere ripetuta.
- Con i kit commerciali, molti loci STR hanno alleli informativi sia per il donatore che per il ricevente nel contesto del donatore non imparentato. Tuttavia, il numero di loci STR informativi può essere limitato a soli 3 tra coppie di trapianti da donatore imparentato. I valori quantitativi che rappresentano la media di appena 3 loci STR sono risultati riproducibili.
- I pazienti con malattie maligne possono avere mutazioni clonali che influiscono su alcuni loci STR. Un allele del paziente può essere assente in uno o più loci STR quando si confrontano gli alleli identificati nel campione pre-trapianto del paziente rispetto al campione post-trapianto. In rare circostanze, può essere rilevato un allele STR extra del paziente in un locus specifico che non era presente nel campione pre-trapianto. Nella maggior parte dei casi queste anomalie sono probabilmente dovute a traslocazioni cromosomiche. Gli alleli mancanti potrebbero anche essere il risultato di una mutazione all’interno delle sequenze STR conservate di accompagnamento dove si trovano i primer della PCR. I dati dei loci STR con alleli mancanti o extra non vengono usati per la quantificazione.
- Se le cellule del paziente prima del trapianto non sono disponibili, possono essere raccolti campioni come tamponi buccali, biopsia cutanea o radici dei capelli dopo il trapianto. Tuttavia, va notato che i campioni buccali possono contenere quantità significative di cellule del donatore.
- Il test non è inteso per il rilevamento della malattia residua minima.
Indicazioni cliniche per il test del chimerismo nel trapianto di cellule ematopoietiche
Documentazione post-trapianto di routine dell’origine donatore/ricevente dei globuli bianchi nel sangue periferico e/o nel midollo. La documentazione dell’incisione può includere l’analisi di sottoinsiemi cellulari specifici del lignaggio, come le cellule T CD3 positive e le cellule mieloidi CD33 positive.
Valutare le cellule del donatore/ricevente in pazienti con funzione midollare inadeguata.
Definire se la malignità ricorrente o nuova ha avuto origine dalle cellule del ricevente o del donatore.
Valutare i rischi prognostici del rigetto e della malignità ricorrente.
Documentare la persistenza delle cellule del donatore dopo il trapianto in pazienti con malattia ricorrente o prima dell’infusione di linfociti del donatore (DLI).
Valutare se si è verificato un rigetto dell’innesto nei riceventi candidati a un secondo trapianto.
Differenziare l’origine delle cellule del donatore nei riceventi che hanno ricevuto un secondo trapianto con un donatore diverso o un trapianto con doppie unità di sangue cordonale.
Rilevare la presenza di cellule di origine materna in pazienti con diagnosi di immunodeficienza combinata grave (SCID).
Verificare l’identità genetica di presunti gemelli identici.
Domande frequenti
Questione: Come vengono analizzati i donatori multipli?
Risposta: È essenziale identificare i loci STR che mostrano almeno un allele STR unico per il paziente e per ogni donatore.
Domanda: Perché l’incisione materna viene testata?
Risposta: I pazienti con diagnosi di immunodeficienza combinata grave (SCID) possono aver subito un trapianto di cellule ematopoietiche di origine materna durante l’infanzia. Alcuni sottoinsiemi di cellule specifiche del lignaggio (specialmente le cellule CD3-positive) possono essere prevalentemente o interamente di origine materna.
Domanda: Qual è la differenza tra chimerismo “completo” e “misto”?
Risposta: Il chimerismo “completo” è usato per riferirsi ad un paziente che mostra un fenotipo post-trapianto nelle cellule ematopoietiche che è tutto di origine del donatore.
Il chimerismo “misto” si riferisce ad un paziente che mostra un misto di fenotipo del paziente e del donatore nelle cellule ematopoietiche dopo il trapianto.
Questione: Cosa succede se un campione di base del ricevente non è disponibile?
Risposta: Sono disponibili diverse opzioni per ottenere un campione del ricevente dopo il trapianto: per un campione di base del ricevente possono essere utilizzati campioni di strisciamento buccale, radice dei capelli o biopsia della pelle. I campioni buccali devono essere usati con cautela perché le cellule del donatore possono essere presenti in quantità significative nei campioni buccali.
Domanda: Cosa succede se un campione di riferimento del donatore non è disponibile?
Risposta: Se il donatore è vivo, ottenere un nuovo campione di sangue. Se il donatore non è vivente, i campioni post-trapianto dovrebbero essere confrontati con la linea di base pre-trapianto del paziente per identificare gli alleli STR che vengono rilevati ma non sono di origine del paziente.
Domanda: Perché l’HLA non è un mezzo fattibile per monitorare l’incisione?
Risposta: I donatori di trapianto sono scelti per essere il più possibile compatibili con il ricevente. Non ci sono marcatori HLA che differenziano il ricevente e il donatore quando sono abbinati, e solo uno o due se non sono abbinati. Inoltre, altre tecnologie sono spesso più sensibili a questo scopo rispetto al monitoraggio degli alleli HLA non corrispondenti; di conseguenza, vengono utilizzati altri loci per fornire profili unici.
Domanda: Cos’è un locus STR informativo?
Risposta: Si tratta di un locus con almeno un allele unico per il ricevente o il donatore. Per essere utile per il calcolo del chimerismo, un locus deve avere alleli unici per entrambi. Ci può essere un gran numero di loci informativi quando si usa un donatore non imparentato per il trapianto, ma molto pochi se si usa un fratello compatibile. A causa delle differenze nell’efficienza di amplificazione degli alleli di ciascun locus, è preferibile ottenere valori medi o mediani da diversi loci per migliorare l’accuratezza. I risultati dei singoli loci sono riproducibili in modo affidabile, quindi anche un solo locus può essere usato per il trending di campioni sequenziali.
Domanda: Cos’è il locus “amelogenina” che è incluso in alcuni pannelli di amplificazione?
Risposta: Il gene dell’amelogenina si trova sui cromosomi X e Y. Non è una STR, ma mostra diverse dimensioni di prodotti sui rispettivi cromosomi. Questo lo rende utile per determinare il sesso. È incluso nel pannello di primer dai fornitori di kit commerciali destinati alla comunità forense, dove la differenziazione X/Y è ampiamente utilizzata. Generalmente non viene utilizzato per l’analisi del chimerismo poiché non può fornire un marcatore femminile unico (un campione maschile include sempre un allele X); né è utile quando si valutano i campioni dopo un trapianto di cellule staminali con corrispondenza di sesso.
Domanda: In che modo l’analisi del chimerismo STR è diversa dalla genotipizzazione?
Risposta: Il “genotipo” si riferisce ai particolari alleli presenti in un determinato locus. La genotipizzazione viene effettuata per stabilire i profili del ricevente e del donatore nell’analisi del chimerismo. Quando l’analisi del chimerismo viene fatta dopo un trapianto di cellule staminali, i profili genotipici del ricevente e del donatore vengono confrontati con il profilo del campione post trapianto per valutare quanto di ogni componente è presente.
La genotipizzazione viene usata anche in altri scenari come la medicina legale e i test di parentela. Gli analisti forensi usano i genotipi per identificare la fonte delle prove nei casi criminali e per escludere le persone dalla considerazione come sospetti. Possono anche identificare i resti umani nei casi “John Doe” e nei disastri di massa. Le determinazioni di parentela sono fatte in modo simile per escludere qualcuno come possibile genitore trovando alleli presenti nel bambino che non corrispondono né alla madre né al padre putativo.
Letteratura citata/consigliata
Bryant E, Martin PJ. Documentazione dell’incisione e caratterizzazione del chimerismo dopo il trapianto di cellule ematopoietiche. In: Forman S, Blune K, Thomas ED, eds. Trapianto di cellule ematopoietiche. 2a ed. Malden, MA: Blackwell Science, 1998.
Bultler J. Forensic DNA typing. Elsevier Academic Press.