La capacità di dimostrare una correlazione tra una coppia di biomolecole è stata notevolmente migliorata da Erik Manders dell’Università di Amsterdam che ha introdotto il coefficiente di correlazione di Pearson ai microscopisti, insieme ad altri coefficienti di cui i “coefficienti di sovrapposizione” M1 e M2 hanno dimostrato di essere i più popolari e utili. Lo scopo di utilizzare i coefficienti è quello di caratterizzare il grado di sovrapposizione tra le immagini, di solito due canali in un’immagine di microscopia multidimensionale registrata a diverse lunghezze d’onda di emissione. Un approccio popolare è stato introdotto da Sylvain Costes, che ha utilizzato il coefficiente di correlazione di Pearson come strumento per impostare le soglie richieste da M1 e M2 in modo obiettivo. L’approccio di Costes presuppone che solo le correlazioni positive siano di interesse, e non fornisce una misura utile del PCC.
Anche se l’uso dei coefficienti può migliorare significativamente l’affidabilità del rilevamento della colocalizzazione, dipende dal numero di fattori, comprese le condizioni di come i campioni con fluorescenza sono stati preparati e come le immagini con colocalizzazione sono state acquisite ed elaborate. Gli studi dovrebbero essere condotti con grande cautela e dopo un’attenta lettura del background. Attualmente il campo è tormentato dalla confusione e un approccio standardizzato non è ancora stato stabilito con certezza. I tentativi di rimediare a questo includono il riesame e la revisione di alcuni coefficienti, l’applicazione di un fattore di correzione del rumore, “Correlazioni corrette dal rumore basate su repliche per misure accurate di colocalizzazione” e la proposta di ulteriori protocolli, che sono stati accuratamente rivisti da Bolte e Cordelieres (2006). Inoltre, a causa della tendenza delle immagini di fluorescenza a contenere una certa quantità di segnale fuori fuoco, e poisson shot e altri rumori, di solito richiedono pre-elaborazione prima della quantificazione. Un accurato restauro dell’immagine tramite deconvoluzione rimuove il rumore e aumenta il contrasto nelle immagini, migliorando la qualità dei risultati dell’analisi di colocalizzazione. Fino ad ora, i metodi più frequentemente utilizzati per quantificare la colocalizzazione calcolare la correlazione statistica delle intensità dei pixel in due canali distinti microscopia. Studi più recenti hanno dimostrato che questo può portare ad alti coefficienti di correlazione anche per gli obiettivi che sono noti per risiedere in diversi compartimenti cellulari. Una quantificazione più robusta della colocalizzazione può essere ottenuta combinando il riconoscimento digitale degli oggetti, il calcolo della sovrapposizione dell’area e la combinazione con un valore di correlazione pixel-intensità. Questo ha portato al concetto di un coefficiente di correlazione di Pearson corretto per l’oggetto.