Proteine del canale di membrana della gap Junction e Connexins
Connexins sono una famiglia di almeno 15 proteine che formano canali di membrana intercellulari di gap junctions e permettono il movimento diffusionale di ioni, metaboliti e potenziali molecole di segnalazione. Queste molecole strutturali svolgono un ruolo importante nella comunicazione bidirezionale tra l’ovocita e le cellule della granulosa. Diverse connexine hanno dimostrato di essere importanti durante la follicologenesi. La proteina Connexin 37 è espressa nei follicoli primari e in crescita. I knockout della Connexina 37 (Gja4) contenevano a 2 settimane di età molti follicoli preantrali in via di sviluppo, ma non si osservano grandi follicoli Graafian (233). Pertanto, istologicamente, sembra che la mancanza di Cx37 blocchi lo sviluppo di follicoli preantrali e antrali. Gli studi di microscopia elettronica hanno mostrato che mentre i knockout di Cx37 contenevano giunzioni di aderenza, mancavano di giunzioni di gap presenti nelle ovaie wild type. Nonostante la mancanza di follicoli Graafian, le ovaie null hanno mostrato strutture più piccole che assomigliano ai corpora lutea che erano 5-10 volte più abbondanti. La luteinizzazione prematura osservata negli animali null suggerisce che la comunicazione giunzionale può essere un meccanismo importante che regola la formazione del corpo luteo. Il knockout della connexina 37 aveva una dimensione media degli ovociti più piccola. Mentre il 52,8% degli ovociti di topi Cx37+/- ha ripreso la meiosi con il 26,8% di questi procedendo alla metafase della meiosi I e il 26% alla metafase della meiosi II, solo il 2,2% degli ovociti Cx37-/- ha ripreso la meiosi in cultura con la grande maggioranza (86,3%) allo stadio germinale vescicale. Tutte queste osservazioni indicano chiaramente che la connexina 37 è essenziale al momento della transizione da pre-antrale a follicolo antrale, molto probabilmente coinvolgendo nel trasporto dei metaboliti necessari per questa transizione.
La proteina Connexin 43 (Gja1) è la connexin più abbondante nell’ovaio, ed è espressa già da E14.5. Le gap junctions della Connexin 43 interconnettono le cellule della granulosa che circondano l’ovocita, così come gli ovociti e le cellule della granulosa. I knockout della Connexina 43 (Gja1) muoiono alla nascita per insufficienza cardiovascolare (234). Le ovaie nei topi null, recuperate al momento della nascita sono insolitamente piccole apparentemente a causa di una carenza di cellule germinali (235). La carenza di cellule germinali è stata fatta risalire fino al giorno 11,5 della gestazione, il che implica che si verifica durante le prime fasi dello sviluppo della linea germinale. Per studiare la follicologenesi postnatale nei topi Gja1-/-, ovaie fetali e neonatali sono state innestate nella capsula renale destra di un topo prkdcscid/Prkdcscid ovariectomizzato e immunocompromesso (236). Gli innesti sono stati rimossi dopo 1-3 settimane e l’istologia ovarica è stata esaminata. Dopo 3 settimane di sviluppo negli innesti di rene, una gamma di stadi follicolari da primordiale attraverso primario, secondario e terziario potrebbe essere visto nelle ovaie wild-type. Al contrario, le ovaie Gja1 null non sono andate oltre i follicoli primari. L’esame degli innesti dopo 1, 2 e 3 settimane ha mostrato che le cellule della granulosa mutante non erano in grado di proliferare. La crescita degli ovociti era anche più lenta nei mutanti rispetto agli animali selvatici. Gli ovociti recuperati dai mutanti Gja1 non potevano essere fecondati. La microscopia elettronica ha anche mostrato che questi ovociti sono anormali rispetto al tipo selvaggio.
La Connexin 43 sembra essere regolata dalle gonadotropine, FSH e LH. Poiché Cx43 è più abbondante nei grandi follicoli antrali rispetto ai piccoli follicoli antrali e preantrali, alcuni hanno ipotizzato che l’FSH induca la sintesi di Cx43. Al contrario, il picco preovulatorio di LH è seguito da un calo del livello di mRNA che codifica Cx43 (237,238). Ulteriori conferme sono venute da esperimenti che utilizzano la somministrazione esogena di gonadotropine. L’iniezione di FSH in ratti ipofisectomizzati ha promosso un aumento della membrana di gap junctional ovarica, mentre l’hCG, che induce l’ovulazione, ha portato a una significativa riduzione della quantità di gap junctions nelle cellule della granulosa (239,240). La somministrazione in vitro di FSH e LH a linee di cellule della granulosa ha corroborato le osservazioni in vivo (241,242). È stato suggerito che gli effetti delle gonadotropine su Cx43 siano mediati dagli ormoni steroidei (243). Anche altre vie di segnalazione possono regolare Cx43, comprese le vie BMP/Smad e MAPK-Ras che hanno recentemente dimostrato di regolare il promotore di Cx43 in vitro (244,245).
Questi risultati implicano che l’accoppiamento gap junctional mediato dai canali Cx43 gioca un ruolo indispensabile sia nello sviluppo della linea germinale che nella follicologenesi postnatale. I fenotipi ovarici molto diversi risultanti dai knockout Cx37 e Cx43 indicano che l’accoppiamento gap-junctional tra l’ovocita e le sue cellule di granulosa cumulo serve un ruolo distinto da quello tra le cellule di granulosa stesse, forse coinvolgendo diverse molecole. La Connexin 32, anch’essa espressa nell’ovaio, quando viene eliminata non sembra influenzare la fertilità (246), suggerendo che si tratta di componenti ridondanti di gap junctions che devono ancora essere identificati.
Collegamenti cellulari addizionali possono essere importanti per la formazione dell’antrum e le interazioni cellula granulosa-oocita. Si pensa che parte della comunicazione intercellulare tra le cellule della granulosa e gli ovociti sia mediata da proiezioni transzonali (TZPs) tra l’ovocita e le cellule della granulosa (41). I microtubuli-TZP (MT-TZP), in particolare, sembrano essere coinvolti in questa comunicazione (41). Le connessioni MT-TZP tra l’ovocita e le cellule della granulosa sono state ipotizzate essere sotto il controllo dell’FSH (247). Il priming di FSH su wild type e Fsh-/- provoca alterazioni nel MT-TZP tali che le TZP sono ritratte dall’ovocita (247). Questo si traduce in cambiamenti nello sviluppo dell’ovocita come misurato dal rimodellamento della cromatina e dall’acquisizione della competenza meiotica (247). Da questi esperimenti, si può ipotizzare che senza priming FSH, le cellule della granulosa hanno un’interazione stabile con l’ovocita, permettendo lo scambio paracrino di fattori. Una volta che le MT-TZP sono ritratte, lo sviluppo dell’ovocita è accelerato. Se fattori specifici dell’ovocita come GDF9 e BMP15 o altri fattori sconosciuti dell’ovocita modulano anche la formazione e/o la relazione delle TZPs deve ancora essere affrontato.