Maggio 12, 2018
Una domanda comune che gli scienziati si pongono sempre quando ottengono il segnale da un saggio basato sugli anticorpi è: “Questo segnale rappresenta veramente la presenza e la quantità della mia proteina?”
La specificità anticorpale è sempre una preoccupazione per gli scienziati. Anche se ci sono un certo numero di metodi di convalida che sono stati utilizzati per il test di specificità, i dati sono spesso sovra-interpretati. I dati di ricerca di vari gruppi hanno dimostrato che alcuni anticorpi monoclonali comunemente usati sul mercato non sono in realtà monospecifici. Possono reagire in modo incrociato con altre proteine e la reattività incrociata può indurre in errore i ricercatori con risultati falsamente positivi e potenzialmente causare effetti collaterali inaspettati e falsi rapporti diagnostici per i clinici.
Quindi quali sono i controlli che dovremmo usare per la convalida della specificità degli anticorpi?
Le linee cellulari e i tessuti che esprimono le proteine bersaglio in quantità elevate possono essere usati come controlli positivi per la convalida degli anticorpi, che possono essere proteine endogene o sovraespresse codificate da un clone cDNA. Tuttavia, il controllo positivo non sarà in grado di confermare la specificità dell’anticorpo. Si può vedere una banda della dimensione corretta o una colorazione positiva nella giusta posizione subcellulare, ma tutti questi potrebbero essere falsi segnali positivi dalla cross-reattività dell’anticorpo. Quindi normalmente per la convalida dell’anticorpo, è necessario un controllo negativo per la valutazione del legame non specifico.
La convalida knockout è finora il miglior controllo negativo per la valutazione della specificità dell’anticorpo. Nella validazione knockout, l’anticorpo viene testato su una linea cellulare knockout che non esprime la proteina bersaglio. A partire dal 2017, OriGene ha collaborato con EdiGene, un innovatore di CRISPR, per produrre cellule double-knockout in modo high-throughput. A differenza della linea cellulare knockout di Horizon, le cellule knockout di OriGene provengono da linee cellulari comunemente usate, come HEK293T o HeLa, rendendo il prodotto più rilevante per i ricercatori. In questa doppia linea cellulare knockout, il bersaglio anticorpale non è presente poiché il gene che codifica la proteina è eliminato o “knocked out”. I campioni delle cellule knockout e delle cellule parentali (wild type) sono testati fianco a fianco contro lo stesso anticorpo, e se l’anticorpo è veramente specifico, dovrebbe rilevare il segnale specifico solo nelle cellule wild type ma non nella linea cellulare knockout. Utilizzando i lisati di queste cellule knockout, abbiamo validato più di 100 anticorpi monoclonali (anticorpi validati KO). Si ritiene che la convalida di knockout offra un vero controllo negativo per il test di specificità degli anticorpi.
Ma la convalida di knockout è sufficiente per confermare la monospecificità di un anticorpo? Terrei questa conclusione con cautela. Prima di tutto, gli effetti fuori bersaglio delle cellule knockout non sono ben studiati in questa fase. Quindi potresti avere una cellula knockout non solo eliminare l’espressione della tua proteina di interesse, ma anche eliminare o ridurre l’espressione di un’altra proteina, che potrebbe essere una proteina che reagisce in modo incrociato con l’anticorpo. Quindi il segnale negativo non significa sempre che l’anticorpo non reagirà con altre proteine eccetto la proteina di interesse. In secondo luogo, test con cellule/tessuto knockout è solo possibile per le proteine non essenziali. Per le proteine essenziali, il knockout è impossibile. Quindi, per queste proteine, avrete bisogno di un altro modo per testare la specificità dell’anticorpo.
Diversi anni fa, OriGene ha sviluppato un metodo di array di proteine per testare la specificità degli anticorpi. Con la più grande collezione al mondo di lisati di sovraespressione, abbiamo realizzato un proteinchip unico che contiene >10k proteine umane sovraespresse in duplicato su un singolo vetrino rivestito di nitrocellulosa. Questa tecnologia proteinmicroarray è stata utilizzata per convalidare la specificità di molti anticorpi monoclonali OriGeneUltraMAB™. Aumentando il numero di proteine sul chip, la cross-reattività di un anticorpo può essere ulteriormente studiata attraverso l’intero proteasoma umano.
In sintesi, il test di specificità degli anticorpi è piuttosto complicato. Ha bisogno di essere convalidato attraverso molteplici strumenti e direzioni.Man mano che la tecnologia continua a progredire, avremo risorse più preziose e procedure standardizzate per la convalida degli anticorpi.Gli scienziati non dovranno affrontare la stessa domanda quando otterranno segnali positivi dai loro saggi basati su anticorpi.