Historický přehled
Zjištění traumaticky indukovaných axonálních abnormalit ve většině experimentálních modelů tupého poranění hlavy, aniž by došlo k narušení myelinu nebo k přímému poškození přilehlých nervových nebo gliových procesů, neposkytla důkaz o přímém roztržení nebo střihu axonů po traumatickém poranění910. To bylo podpořeno studiemi mrazových zlomenin, provedenými v časných fázích axonálního poranění, které neprokázaly ani okamžité narušení internodálního myelinu, ani časnou ztrátu gliových a axonálních spojů, což naznačuje, že samotná myelinová pochva není bezprostředně poškozena silami poranění.23 V této fázi obě výše uvedené skupiny postulovaly, že síly traumatického poranění působí nejprve na axolemmu nebo axoplazmu, zatímco myelinovou pochvu šetří. V rámci této hypotézy by mechanické síly poranění mohly natáhnout nebo poškodit axolemmu až na její biomechanické meze, načež by došlo k selhání iontové homeostázy a zahájení reaktivní axonální změny.
V sérii následných výzkumů na mozkové tkáni lidí1222 i zvířat2124 však Povlishock a jeho kolegové poskytli údaje podporující iniciační roli intraaxonálního cytoskeletu. Jejich studie odhalily složitou sekvenci intraaxiálních událostí, které postupovaly k reaktivním axonálním změnám. Konkrétně pomocí protilátek zaměřených na neurofilamentovou složku cytoskeletu zjistili, že během jedné hodiny po poranění došlo k fokální akumulaci 68 kDa podjednotky (NF-L) a tento nárůst byl dramatický do dvou hodin. S přibývajícím časem se neurofilamenta dezorganizovala a špatně zarovnávala vzhledem k podélné ose axonu. Nebyl zjištěn žádný úbytek nebo rozpuštění neurofilament. Tyto údaje tedy neodpovídaly degradaci cytoskeletu zprostředkované neutrálními proteázami. Místo toho nárůst 68kDa neurofilamentové podjednotky podpořil možnost traumaticky vyvolané změny uspořádání neurofilamentového poolu. Dále nebyly v této sérii experimentů zjištěny žádné ultrastrukturální důkazy přímého narušení axolemmy. Bylo zjištěno skládání a roztahování axolemmy, které bylo přičítáno probíhající reaktivní axonální změně. Tato zjištění naznačují, že přímý mechanický účinek na cytoskelet axonálního válce byl klíčovou událostí v iniciační patogenezi axonálního poškození.
Jiné přístupy naznačují, že axolema se podílí na iniciaci reaktivní axonální změny. Maxwell et al použili model nervové trakce k analýze morfologických změn uvnitř poškozených axonů.18 Tito autoři poskytli důkaz, že počátečními místy poškození jsou po nedestruktivním poranění natažením Ranvierovy uzly, z nichž se u některých vyvinou „uzlové bleby“. Tyto bleby jsou axolemou omezené výběžky axoplazmy do perinodálního prostoru a jsou nejčetnější do 15 minut od poranění, ale méně četné v pozdějších intervalech. vývoj nodálních blebů koreloval se ztrátou hustého podkoží axolemy. U poškozených axonů s nodálními bleby byla neurofilamenta dezorganizovaná, odchýlená od podélné osy axonu a rozšířená do blebů. Naproti tomu mikrotubuly si zachovaly své podélné uspořádání a neodchýlily se do bleb. Kvantitativní analýza tohoto materiálu ukázala, že v axoplasmě uzlů s přidruženými uzlovými výdutěmi došlo k výraznému úbytku mikrotubulů a ke zvětšení rozestupu neurofilament. Tato ztráta mikrotubulů mohla narušit rychlý axoplazmatický transport, což mělo za následek ohniskové nahromadění membránových organel v přilehlých paranodálních oblastech axonu a vytvoření axonálních výpotků. Kromě toho tito pracovníci poskytli první cytochemické důkazy na podporu myšlenky influxu vápníku do myelinizovaných nervových vláken poraněných natažením .25 Použití oxalát-pyroantimonátové techniky pro lokalizaci vápníku ukázalo zvýšený obsah pyroantimonátového precipitátu v nodálních blebech 15 minut po poranění natažením. To korelovalo se snížením značení aktivity membránové pumpy Ca2+ATPázy na uzlovém axolematu.26 Ranvierův uzel je specializovaná oblast axolematu, ve které jsou lokalizovány skupiny Na+ kanálů, ATPázou poháněné pumpy pro vápník a Na+/Ca2+ výměník.2027 Ztráta aktivity membránové pumpy v uzlovém axolematu by proto mohla představovat mechanismus pro influx volného vápníku do Ranvierových uzlů po traumatickém poranění. Tyto důkazy podporují hypotézu, že síly traumatického poranění vedou k fokální pertubaci axolemmy s výsledným influxem volného vápníku schopného aktivovat subpopulaci neutrálních proteáz.25
Biofyzikální výzkumy použily nové techniky k analýze axolemmy v experimentálních podmínkách analogických axonálnímu poranění. Po mírném poranění protažením dochází u vláken sedacího nervu dospělého potkana k sérii zúžení a rozšíření. Tato změna tvaru je známá jako korálkování.28-30 K přeměně v podstatě válcovitého tvaru normálního nervového vlákna na korálkovité dochází rychle, během 10 až 20 sekund po zahájení protažení. Původní experimentální údaje naznačovaly, že se jedná o mechanismus související s axolemou, cytoskeletem nebo obojím. V tomto modelu se transmembránový protein β1-integrin váže jak na extracelulární matrix, tak na cytoskelet.14 Napětí působící na extracelulární matrix je prostřednictvím β1-integrinu signalizováno cytoskeletu s následnou změnou jeho integrity a prostorového uspořádání. Nedávná studie však naznačila, že beading nevyžaduje propojený cytoskelet, a dospěla k závěru, že axolemma je iniciačním místem nebo místem zúžení beadingu.31 Je hodno spekulace, že beading může být součástí biologického procesu, který je v literatuře popisován jako reaktivní axonální změna v souvislosti s traumaticky vyvolaným axonálním poraněním.
V posledních čtyřech letech se prokázala účast axolemmy v patogenezi axonálního poranění. Maxwell et al. prokázali, že těžké traumatické poranění mozku způsobené bočním zrychlením je schopno přímo roztrhnout axolemma u primátů.32 Tato studie jako první poskytla ultrastrukturální důkazy, které podpořily koncept axonálního střihu při traumatickém poranění mozku. Ztráta integrity axolemy byla spojena s rychlým rozpadem axonálního cytoskeletu. V axonech, které vykazovaly axolemální roztržení nebo fragmentaci, bylo vláknité uspořádání cytoskeletu nahrazeno flokulačním precipitátem, který odpovídal rychlému rozpuštění základních cytoskeletálních proteinů. Tyto změny byly zjištěny během několika minut po poranění, ale objevily se pouze v subpopulaci jemně myelinizovaných axonů po těžkém poranění. Tyto morfologické změny představovaly akutní reakci axonů na poranění a byly označeny jako „primární axotomie“ – definovaná tak, že k ní dochází během několika minut po poranění, na rozdíl od opožděné sekundární axotomie, která se vyvíjí po dobu několika hodin. Ve stejném experimentálním materiálu nebylo hodinu po poranění zaznamenáno žádné narušení axolematu. To naznačuje, že narušená axonální membrána se znovu uzavře během hodiny po poranění.
Po této publikaci Povlishock a jeho kolegové přehodnotili svou hlavní hypotézu, která nezahrnovala roli axolemmy v iniciaci traumaticky vyvolaného axonálního poranění. Po zralé úvaze vyslovili domněnku, že přímé natržení axolemmy může představovat nejzávažnější konec řady axolemálních poruch.33 To byl zásadní zlom, neboť po mnoho let tato výzkumná skupina zastávala názor, že v žádném z četných paradigmat, která zkoumala, neexistují důkazy o přímých změnách axolemmy po poranění. Navíc tvrdili, že patobiologie traumaticky vyvolaného axonálního poškození je důsledkem přímého narušení axoplazmatického transportu v důsledku toho, že síly zranění přímo narušují axonální cytoskelet.71221
V sérii experimentů určených ke zkoumání této problematiky použili Povlishock a jeho kolegové extracelulární stopovací látku, křenovou peroxidázu (HRP), aby zjistili, zda jsou u traumatických poranění mozku mírné a střední závažnosti detekovatelné přímé změny axolemmy.3334 Tento nový přístup byl založen na principu, že makromolekulární stopovací látky, jako je HRP, jsou normálně vyloučeny z axoplazmy neporušenou axolemou. Proto by detekce intraaxonální peroxidázové aktivity představovala důkaz narušení axolemy. Kromě toho by místo peroxidázové aktivity vymezilo počáteční místo axonální pertubace, což by umožnilo nahlédnout do iniciačních faktorů podílejících se na patogenezi sekundární axotomie. Jejich zjištění ukázala, že patobiologie traumaticky vyvolaného axonálního poškození je heterogenní a komplexní proces zahrnující mnohočetnou a různorodou iniciační patologii.
Zejména závažnost traumatického poškození určuje následné děje v axolemmě a cytoskeletu, což vede k rozdílné odpovědi na inzult. Konkrétně po středně těžkém poranění byla zjištěna přímá pertubace axolemmy odrážející se v její změněné propustnosti pro makromolekuly.33-35 To bylo spojeno s rychlým lokálním zhutněním axonálních neurofilament, o čemž svědčí snížení interfilamentární vzdálenosti. Po mírném traumatickém poranění mozku však nebyly zjištěny žádné známky změn v axolemmě a byl zjištěn jiný soubor cytoskeletálních abnormalit s chybným uspořádáním a axonálním otokem. Rozdílná reakce na poranění byla již dříve popsána u modelu axonálního poranění při kompresním zatížení.36 Při nízkém tahovém zatížení vykazovaly axony narušení axoplazmy nezávisle na jakékoliv změně integrity axolemmy, což zcela odpovídá změnám popsaným u mírného traumatického poranění mozku. Při těžších poraněních se u stejných axonů objevily axolemální změny, které korelovaly s dramatickým axoplazmatickým selháním. Následné studie rozšířily tato zjištění tím, že ukázaly, že tyto změny v axolemmě a v cytoskeletu nejsou modelově3435 ani druhově specifické.37 Po prokázání traumaticky vyvolaných změn v axolemální propustnosti navíc studie naznačily, že se na iniciaci cytoskeletálních dějů může podílet vápník. Tento zdánlivý rozpor s dřívějšími názory vyplýval z toho, že předpokládaly, že vápník působí prostřednictvím dosud neidentifikovaných mechanismů. Namísto aktivace proteolytických enzymů může vápník působit méně dramaticky a měnit postranní části neurofilament, což způsobuje kolaps neurofilament, jehož výsledkem je jejich zvýšená hustota balení. Je myslitelné, že tyto neurofilamentové postranice by mohly být buď štěpeny procesy zprostředkovanými vápníkem, nebo deforylovány působením kináz a fosfatáz, což by vedlo ke změně trojrozměrného uspořádání neurofilament.1
Závěrem lze říci, že kontroverze týkající se úlohy axolemmy v patobiologii traumaticky vyvolaného axonálního poškození byla do jisté míry vyřešena. Nyní panuje shoda, že narušení axolemmy je počáteční událostí u některých forem traumatického poškození. Mechanistický základ sekundární axotomie se však nyní jeví jako stále složitější, přičemž u těžších forem traumatického poškození mozku byly prokázány změny v axonálním cytoskeletu
.