Animals
S. purpuratus byl chován v umělé mořské vodě při teplotě 14 °C. L. anatina byly sbírány v červnu 2016 v mokřadech Xiangshan, okres Xiangshan, město Hsinchu, Tchaj-wan (GPS souřadnice 24.770779, 120.910742 E), převezeny do laboratoře na ledu a poté ihned pitvány.
Konstrukce a plazmidy
Pro stanovení enzymatické aktivity SpAIDL a LaAIDL byly vytvořeny příslušné bakteriální expresní vektory pASK-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID pro SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9, LaAIDL1, 2 a HsAID. Otevřené čtecí rámce jednotlivých SpAIDL byly amplifikovány z genomové DNA pomocí PCR s použitím polymerázy Phusion a primerů obsahujících restrikční místa SpeI a XhoI (doplňková tabulka 1). Produkty PCR byly štěpeny pomocí SpeI a XhoI (New England Biolabs) a vloženy do míst NheI/XhoI v pASK-TadA (dar Dr. Niny Papavasiliou, Rockefeller University, New York), kde nahradily otevřený čtecí rámec TadA. U SpAIDL9 tato klonovací strategie změnila třetí aminokyselinu z fenylalaninu na serin a tato mutace F3S byla vrácena zpět na F3 pomocí soupravy Quikchange mutagenesis kit (Stratagene) s primery SPA9S3FT/SPA9S3FB (doplňková tabulka 1). HsAID byl amplifikován z plazmidu obsahujícího lidský AID v plné délce (pCDF-AID, dar Dr. Niny Papavasiliou, Rockefeller University, New York). Klonovací strategie změnila druhou aminokyselinu z aspartátu na alanin a D2A byla vrácena zpět na D2 pomocí soupravy Quikchange mutagenesis (Stratagene) s primery hAIDA2DT/hAIDA2DB (doplňková tabulka 1). Prázdný pASK byl vytvořen NheI/XhoI štěpením pASK-TadA, doplněním převisů pomocí Klenow polymerázy a ligací pomocí T4 DNA ligázy (Thermo Scientific). Otevřené čtecí rámce jednotlivých LaAIDL byly amplifikovány z cDNA L. anatina a klonovány do klonovacího vektoru pJET1.2/blunt (Thermo Scientific). Otevřené čtecí rámce LaAIDLX byly vyříznuty pomocí SpeI a XhoI (New England Biolabs) a klonovány do míst XbaI/XhoI v pASK_V5-SpAID4a (popsáno níže), čímž byl nahrazen insert SpAID4a. Je třeba poznamenat, že klonované fragmenty obsahují na svých 3′ koncích původní stop kodony, takže exprimovaný protein neobsahuje značku V5.
Expresní konstrukty pro mutanty aktivního místa SpAIDL1 a LaAIDL1 (SpAIDL1 H86R E88Q, SpAIDL1 H86R E88Q C123A C126A, a LaAIDL1 H81R E83Q H298R E300Q) byly vytvořeny místně řízenou mutagenezí z příslušných plasmidů divokého typu (nebo jednotlivých mutantů) buď pomocí soupravy pro mutagenezi Quikchange (SPA1H85RE87QT/SPA1H85RE87QB pro SpAIDL1 RQ), nebo konvenční PCR s použitím 5′-fosforylovaných primerů (SPA1CCAA-P/SPA1CCAAB pro druhou sadu změn v SpAIDL1 RQAA a LaA1H81RE83QB/LaA1H81RE83Q-P a LaA1H298RE300QB/LaA1H298RE300Q-P pro SpLaAIDL1 RQRQ) s následným štěpením DpnI, ligací pro cirkulaci produktů a transformací do kompetentní E. coli.
Pro sledování úrovně exprese rekombinantního proteinu v E. coli byly vytvořeny bakteriální expresní konstrukty pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID. pASK_V5 byl vytvořen annealováním oligonukleotidů pASK_V5F/pASK_V5R (doplňková tabulka 1) obsahujících sekvenci značky V5 a jejich ligováním do míst NheI/SalI pASK-TadA. Plazmidy pASK-SpAIDLX/LaAIDLX byly použity jako šablony pro amplifikaci příslušných cDNA bez stop kodonu pomocí Phusion polymerázy a primerů uvedených v doplňkové tabulce 1 a klonovány do míst NheI/XhoI (pro fragmenty SpAIDLX a HsAID) nebo XbaI/XhoI (pro fragmenty LaAIDLX) pASK_V5. HsAID byl amplifikován z pASK-hAID. Sekvence obou, SpAIDL9 a HsAID, byly touto klonovací strategií opět změněny a byly změněny zpět na správné sekvence, jak je popsáno výše.
Příprava genomické DNA
Genomická DNA obou, S. purpuratus a L. anatina, byla purifikována pomocí sady gDNA Spin Kit Tissue (Bioman) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, přibližně 1 × 106 coelomocytů S. purpuratus a 100 mg tkáně L. anatina bylo přidáno do oddělených mikrocentrifugačních zkumavek, homogenizováno v 200 µl pufru GT (Bioman) obsahujícího 200 mg proteinázy K a inkubováno po dobu 30 minut při 60 °C, aby došlo k úplné lyzi buněk. Po přidání 200 µl pufru BG (Bioman) se vzorky vortexovaly a inkubovaly 20 min při 70 °C. Následně bylo přidáno 200 µl ethanolu a celý vzorek byl vložen na spinovou kolonu GD (Bioman). Promývání 400 µl WI pufru (Bioman) a 600 µl promývacího pufru bylo provedeno centrifugací při 10 000×g po dobu 30 s. Následovala eluce genomové DNA pomocí 100 µl elučního pufru (10 mM Tris pH = 8,0), který byl předehřátý na 60 °C.
Příprava RNA a syntéza cDNA
Celomová tekutina S. purpuratus byla nasáta injekční stříkačkou přes periostomální membránu a okamžitě smíchána se stejným objemem CMSFW-EI (0,53 M NaCl, 10 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 11 mM Na2SO4, 30 mM EDTA, 50 mM imidazol). Coelomocyty byly odstředěny a resuspendovány v 800 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman). Z jednotlivých zvířat byl vypreparován jícen, tenké střevo, tlusté střevo a gonády u S. purpuratus a stopka, cékum, gonády a střevo u L. anatina. Malé kousky pevných tkání S. purpuratus a L. anatina byly přidány do 200 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman) a vzorky byly homogenizovány v Bullet Blenderu (Next Advance) pomocí 0,5 mm ZrO kuliček. Nerozpustné zbytky byly odstředěny a supernatanty byly převedeny do čerstvých zkumavek obsahujících 600 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman) a 200 μg glykogenu jako nosiče. Celková RNA byla poté přečištěna podle protokolu výrobce. Pro odstranění zbytkové gDNA a dalších kontaminantů byla RNA S. purpuratus dále zpracována pomocí soupravy Turbo DNA-free kit (Ambion) nebo soupravy RNeasy mini kit (Qiagen). Souprava Turbo DNA-free kit (Ambion) byla použita podle protokolu výrobce s tím rozdílem, že pro štěpení DNasy byly přidány navíc MgCl2 (2,5 mM) a CaCl2 (1 mM). Souprava RNeasy mini kit (Qiagen) byla použita podle protokolu výrobce.
Přibližně 250-500 ng RNA S. purpuratus a L. anatina z každé tkáně bylo převedeno na cDNA pomocí ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen), respektive ToolsQuant II Fast RT Kit (Biotools). V obou případech byly použity náhodné hexamery a postupovalo se podle pokynů výrobce.
Rychlá amplifikace konců cDNA
5′ a 3′ konce transkriptů SpAIDL9 byly amplifikovány pomocí soupravy SMARTer RACE (Clontech) a genově specifických primerů SPA9CR1, SPA9CR2, SPA9CF1, SPA9CF2 (viz doplňková tabulka 2) podle pokynů výrobce. Produkty PCR obsahující 5′ a 3′ konce transkriptů byly klonovány do klonovacího vektoru pJET1.2/blunt (Thermo Scientific) a jednotlivé klony byly kompletně sekvenovány.
Sekvenční analýza genů SpAIDL
Genomová DNA tří genů S. purpuratus (Sp105, Sp111, Sp112) byly použity jako templáty pro amplifikaci otevřených čtecích rámců genů SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9 pomocí polymerázy Phusion a primerů uvedených v doplňkové tabulce 2. Produkty PCR byly klonovány do klonovacího vektoru pJET1.2/blunt (Thermo Scientific). Plazmidy byly přečištěny pomocí sady Tools mini plasmid kit (Biotools) a předány komerční službě (Genomics Taiwan) k sekvenování s použitím buď dopředných, nebo zpětných primerů pJET1.2.
Pro každý gen bylo shromážděno nejméně osm sekvencí od každého mořského ježka a sekvence primerů byly před zarovnáním sekvencí vyloučeny. Nukleotidové sekvence pro každý gen byly nejprve zarovnány v rámci každého S. purpuratus pomocí CLUSTALW (www.genome.jp/tools/clustalw) a poté byly vybrány dominantní sekvence odpovídající dvěma alelám pro následné porovnání mezi jednotlivými mořskými ježky.
Analýza exprese genů
Komplementární DNA ze tří jedinců S. purpuratus (Sp146, Sp147, Sp148) a dvou jedinců L. anatina (La1 a La3) byla použita jako templáty pro testování exprese buď SpAIDL1, 2, 3, 4a a 9, nebo LaAIDL1 a 2 pomocí kvantitativní PCR. Každá reakce qPCR (10 μl) obsahovala 5 μl Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), primery (0,1 μM) (viz doplňková tabulka 3) a 1 μl templátu a pro každý vzorek byly nastaveny dvě technické replikace. Reakce qPCR byly provedeny v systému 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems), přičemž byl použit počáteční denaturační krok při 95 °C po dobu 20 s, po němž následovalo 40 cyklů po 3 s při 95 °C a 30 s při 60 °C. Pro stanovení hladin genové exprese byly použity standardní křivky a pro normalizaci byly použity housekeepingové geny (Sp18S pro S. purpuratus a LaRPL39 pro L. anatina).
Model bakteriální infekce
Vibrio diazotrophicus byly pěstovány v tekutých kulturách Difco marine broth (Becton Dickinson) při 30 °C a 250 otáčkách za minutu přes noc. Náhodně bylo vybráno šest zdravých mořských ježků, kteří byli rozděleni do dvou skupin, experimentální a kontrolní. Každému zvířeti byla odebrána alikvotní část coelomové tekutiny (0,5 ml) v čase t = 0. Mořským ježkům v experimentální skupině byla aplikována suspenze živých Vibrio diazotrophicus ve 200 µl sterilní umělé mořské vody, přičemž množství bakterií bylo pro každého mořského ježka upraveno tak, aby odpovídalo 106 buňkám/ml celkového objemu coelomové tekutiny. Kontrolní skupině bylo aplikováno 200 µl sterilní mořské vody. V t = 6, 24 a 48 hodin bylo každému zvířeti v každé skupině odebráno 200 µl coelomové tekutiny. Z coelomocytů získaných v každém časovém bodě byla extrahována RNA a ze vzorků t = 0 byla připravena také genomová DNA. Páry primerů pro analýzu genové exprese (doplňková tabulka 3) byly nejprve testovány na vzorcích genomové DNA, aby se zajistilo, že mohou amplifikovat příslušný gen od každého jedince, a to i přes pozoruhodnou úroveň polymorfismu v jejich sekvenci v rámci populace S. purpuratus (viz obr. 1b). Pro měření hladin genové exprese byla použita kvantitativní RT-PCR (jak je popsáno výše) s nejméně dvěma technickými opakováními pro každý vzorek. Hodnoty exprese byly nejprve normalizovány na hladiny 18S v každém vzorku a poté na hodnoty při t = 0 pro každé zvíře. Pro experimentální a kontrolní skupinu byla použita tři biologická opakování a jsou uvedeny všechny datové body.
CDA testy s reportérem rezistence vůči kanamycinu
Byl použit optimalizovaný protokol široce používaného testu pro měření aktivity polynukleotidů CDA26. Plazmid pTAC-Kan deaminase reporter obsahující bodovou mutaci L94P v genu KanR a jednotlivé expresní vektory pASK-SpAIDLX/LaAIDLX byly postupně transformovány do UNG-deficitního kmene BH156 E. coli. Jako pozitivní a negativní kontrola sloužil expresní vektor lidského AID pASK-HsAID a prázdný vektor pASK. Pro deaminázový test bylo nejméně osm jednotlivých kolonií pro každou předpokládanou deaminázu pěstováno v LB bujónu (obsahujícím 50 μg/ml ampicilinu (Amp), 50 μg/ml spektinomycinu (Spc) a 17 μg/ml chloramfenikolu (Cam)), dokud optická hustota při 600 nm nedosáhla 0,3. Každá kultura byla poté rozdělena na polovinu. Zatímco IPTG (1 mM) byl přidán do obou z nich, anhydrotetracyklin (AHT) (0,2 μg/ml) byl přidán pouze do jedné z nich, aby se indukovala exprese SpAIDLX/LaAIDLX. Po inkubaci po dobu 3 hodin při 37 °C a 200 otáčkách za minutu byly kultury odstředěny, promyty PBS a naneseny na LB destičky obsahující buď 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc a 17 μg/ml Cam, nebo 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc, 17 μg/ml Cam a 30 μg/ml kanamycinu (Kan). Frekvence reverze byly vypočteny jako poměr počtu kolonií KanR k celkovému počtu kolonií na desce Amp+Spc+Cam. Relativní frekvence reverze pak byla stanovena jako poměr frekvencí reverze z jedné dvojice identických bakteriálních kultur, v nichž byla transkripce KanR indukována pomocí IPTG buď v přítomnosti, nebo v nepřítomnosti exprese deaminázy. Pro potvrzení, že kolonie KanR byly skutečně výsledkem deaminace DNA, byly plasmidy pTAC-Kan z více kolonií přečištěny a reverze stop kodonu potvrzena sekvenováním DNA.
CDA testy s použitím rpoB jako reportéru
Byl použit optimalizovaný protokol široce používaného testu pro měření aktivity polynukleotidů CDA35. Jednotlivé expresní vektory pASK bezobratlých deamináz byly samostatně transformovány do UDG-deficientní E. coli BH156. Jednotlivé bakteriální kolonie byly inokulovány čtyřmi ml LB média obsahujícího 100 µg/ml Amp, 17 µg/ml Cam a 0,3 µg/ml AHT. Kultury byly kultivovány 24 hodin při 37 °C a 230 otáčkách za minutu, alikvoty byly naneseny na LB agarové plotny obsahující 100 µg/ml Amp nebo 100 µg/ml rifampicinu a kultivovány při 37 °C přes noc. Kolonie byly spočítány a frekvence reverze byla vypočtena jako poměr počtu kolonií RifR k počtu kolonií AmpR ze stejné kultury. Jako pozitivní a negativní kontrola sloužily kultury exprimující HsAID nebo obsahující prázdný expresní vektor pASK. Pro každý expresní konstrukt bylo testováno nejméně osm kultur. Pro určení identity mutací v genu rpoB z kolonií rezistentních k rifampicinu byla provedena PCR kolonií z 24 jednotlivých kolonií pomocí polymerázy Phusion a páru primerů rpoBF/rpoBR. Produkty PCR byly přečištěny v gelu a podrobeny sekvenování s použitím primeru rpoBF. Mutace byly identifikovány porovnáním se sekvencí WT (Genbank acc. CP024859.1, nt 2321219-2321797).
Proteinová exprese deamináz bezobratlých v E. coli
Pro sledování úrovně exprese SpAIDLX/LaAIDLX v deaminázových testech byl pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX transformován do UNG-deficientní BH156. Jednotlivé kolonie byly pěstovány v LB bujónu (obsahujícím 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc a 17 μg/ml Cam), dokud optická hustota při 600 nm nebyla 0,3. Ke kultuře byly přidány IPTG (1 mM) a AHT 0,2 (μg/ml) k indukci exprese proteinů. Po inkubaci po dobu 3 hodin (37 °C, 200 otáček za minutu) byly kultury peletovány a promyty PBS. Pelety byly lyzovány v pufru pro vzorky 2x SDS, desetkrát zředěny a separovány na dvojici 10% SDS-PAGE gelů. Zatímco jeden gel byl obarven Coomassieho modří, aby se posoudilo, zda bylo načteno stejné množství proteinů, druhý gel byl polosuchým přenosem přenesen na PVDF membrány a deaminázy značené V5 byly detekovány pomocí myší primární protilátky anti-V5 (Abcam, ab27671) a sekundárního antiséra králík-anti-myš spojeného s křenovou peroxidázou (Jackson ImmunoReasearch). Chemiluminiscenční signály byly vizualizovány pomocí chemiluminiscenčního HRP substrátu Immobilon Western (Millipore) a rentgenového filmu nebo zobrazovacího systému ChemiDoc Touch (BioRad). Nezkrácené snímky všech obarvených proteinových gelů a westernových blotů jsou uvedeny na doplňkovém obr. 5. Všechny experimenty s bakteriální expresí byly provedeny ve dvou opakováních.
Bioinformatika
Srovnání sekvencí s genomem mořského ježka bylo provedeno pomocí BLAST, BLASTP nebo BLASTN na https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi nebo www.echinobase.org s použitím standardních parametrů nebo s vypnutým filtrem nízké složitosti. Zarovnání vícenásobných sekvencí bylo provedeno pomocí programu CLUSTALW a optimalizováno ručně na základě předpokládaných sekundárních strukturních rysů. Fylogenetické a molekulární evoluční analýzy byly provedeny pomocí programu MEGA (verze 7)36.
Dostupnost dat
Sekvenční data, která podporují výsledky této studie, byla uložena v Genbank s následujícími přístupovými kódy: SpAIDL1 (MH106904, MH106887, MH106888, MH106889, MH106891), SpAIDL2 (MH048921, MH048922, MH048923, MH048924, MH048925), SpAIDL3 (MH106892, MH106893, MH106894, MH106895, MH106896, MH106897), SpAIDL4a (MH106905, MH080287, MH080288, MH080289, MH080290), SpAIDL9 (KY241384, KY241385, MH106898, MH106899, MH106900, MH106901, MH106902, MH106903), LaAIDL1 (MH106906), LaAIDL2 (MH106907).