Animal pole domain mořského ježka je neurogenní patternovací centrum závislé na Six3 | Vývoj

VÝSLEDKY

Identifikace kandidátních regulačních genů animal pole domain (APD)

Pro definování raného regulačního stavu APD v embryu mořského ježka jsme současně použili bioinformatické i experimentální přístupy k identifikaci genů kódujících regulační proteiny, které jsou exprimovány v thisteritoriu před gastrulací. Bioinformatický přístup využíval úsilí o anotaci sekvencí genomu z naší laboratoře (Burke et al., 2006) a z jiných laboratoří (Howard-Ashby et al.,2006a; Howard-Ashby et al.,2006b; Materna et al.,2006; Tu et al.,2006), které dokumentovaly vzorce exprese APD mnoha genů kódujících transkripční faktory a/nebo které byly ortology faktorů, o nichž je známo, že fungují v nervové tkáni u embryí jiných druhů. Experimentálnípřístup porovnával zastoupení RNA u embryí s injikovanou mRNA Δcadherinu oproti normálním embryím ve stadiu líhnutí blastuly. Embrya postrádající jadernýβ-katenin se skládají téměř výhradně z ektodermu živočišného pólu, jak ukazují vzorce exprese foxq2 a hbn. U normálních embryí jsou tyto mRNA omezeny na živočišný pól počínaje stadiem blastuly (Burke et al., 2006;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008) a domény jejich exprese ve stadiu mezenchymu blastuly se překrývají v živočišném pólu (obr. 1B-D). Jak vývoj pokračuje gastrulací, doména buněk exprimujícíchhbn vytváří prstenec, který obklopuje buňky exprimujícífoxq2 (obr. 1F). Když je kanonická Wnt, Nodal a BMP signalizace eliminována injekcí ΔcadherinmRNA, zvířecí polovina embrya exprimuje foxq2, zatímco většina zbývající části embrya exprimuje hbn (obr. 1H). Tyto vzorce naznačují, že embrya bez kanonické Wnt a Nodal-BMP2/4 signalizace se skládají téměř výhradně z dramaticky rozšířené APD, jejíž vnější hranice jsou vymezeny expresí hbn. Foxq2 a hbntranskripty se objevují v APD během pozdního stádia štěpení/raného stádia blastuly,což naznačuje, že minimálně v této době dochází ke specifikaci APD.

Pro identifikaci časných regulačních genů APD jsme porovnávali relativníkoncentrace jednotlivých mRNA v embryích s mRNA Δcadherinu oproti embryím injikovaným glycerolem ve stadiu líhnutí blastuly pomocí microarrayreprezentující všechny genové predikce nalezené v sekvenci genomu mořského ježka(Wei et al., 2006). Tato fáze označuje přechod mezi štěpením a začátkem morfogeneze a je krátce po době, kdy byly zjištěny nejranější markery APD (Burke et al., 2006;Howard-Ashby et al., 2006a;Howard-Ashby et al., 2006b;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008). Byl identifikován soubor genů kódujících transkripční faktory a složky signálních drah s průměrně nejméně trojnásobně vyšší expresí ve dvou sériích embryí s mRNAΔcadherinu. Tyto geny se částečně překrývaly se souborem kandidátních genů identifikovaných bioinformatickým přístupem. Kombinované soubory obsahují 27 genů a tvoří prozatímnísoubor regulačních genů APD (E-APD)(tabulka 1).

Pro identifikaci nejdříve exprimovaných genů v rámci souboru E-APD jsme prozkoumali časové profily exprese vytvořené pomocí microarray, jak bylo popsánopředtím (Wei et al., 2006).Vzorce byly ověřeny porovnáním s publikovanými daty(Burke et al., 2006;Croce et al., 2006;Howard-Ashby et al., 2006a;Howard-Ashby et al., 2006b;Materna et al., 2006;Sweet et al., 2002;Takacs et al., 2004;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008) a našimi whole-mount in situ hybridizacemi (naše nepublikovaná pozorování). Geny byly roztříděny do tří skupin: ty, které byly maximálně zastoupeny v populaci otcovské RNA (obr. 2A), ty, které byly silně regulovány během štěpných stadií (obr. 2B,C), a ty, které byly regulovány mezi pozdními štěpnými stadii a časnými stadii gastruly (obr. 2D). Nejprve jsme se zaměřili na členy skupiny časné embryonální exprese. Jak je uvedeno níže, pomocí testů ztráty i zisku funkce jsme identifikovali jeden z nich, Sp-Six3(dále jen Six3), který působí na vrcholu nebo blízko vrcholu hierarchie APD generů.

Six3 je exprimován na počátku APD

Identifikace mořského ježka six3 je jednoznačná, protože jeho sekvence je velmi vysoce konzervovaná v homeodoméně (98 % shodná sHsSix3), doméně six (91 %) a groucho interakční doméně (71 %) (viz obr. S1 v doplňkovém materiálu). Potvrdili jsme předchozí studie ukazující, že Six3 je dynamicky exprimován během vývojeParacentrotus lividus (Poustka etal., 2007), druhu blízce příbuzného Strongylocentrotuspurpuratus použitého v této studii. Nejdůležitějšími rysy je, že transkriptySix3 jsou exprimovány v živočišné hemisféře během pozdního vývoje (obr. 3A), v APDve stádiu vylíhlé blastuly (obr. 3B) a poté ve dvou kruzích (obr. 3G,H), jednom v blízkosti periferie APD(obr. 3C-F,H) a druhém v endomesodermu (obr. 3C-G), během stádia mesenchymu blastuly. Během gastrulace je Six3 exprimován v některých buňkách sekundárního mezenchymu rozptýlených po celé blastocoel a na konci archenteronu(obr. 3I, šipka), jak uvádí Howard-Ashby et al. (Howard-Ashby etal., 2006b), v buňkách živočišného pólu(obr. 3I,J) a ústního ektodermu(obr. 3J,K). Ve stadiu pluteus je Six3 RNA detekována ve dvou shlucích buněk lemujících ústa(obr. 3K, šipky) a v pásucilií (obr. 3K).

Celkové hladiny mRNA Six ve stadiu časného mezenchymu blastula se po injekci mRNA Δcadherinu významně nemění(tab. 1). In situhybridizace jsou v souladu s tímto výsledkem a ukazují, že distribucese u embryí s injikovanou Δcadherinovou mRNA liší, chybí ve vegetačních buňkách a zachovává širokou expresi živočišné polokoule, která je založenapřed restrikcí procesy závislými na kanonickém Wnt (viz obr. S2 v doplňkovém materiálu).

Funkce Six3 je nutná pro tvorbu APD a diferenciaci neuronů

Pro testování funkce Six3 jsme do oplozených vajíček injektovali dvě různá morfolina blokující translaci Six3, z nichž každé vyvolalo stejné vývojové defekty. Embrya ve 3 dnech nabyla zaoblené morfologie(obr. 4A,B) a spikuly byly buď redukované, nebo chyběly. Ektoderm živočišného pólu postrádal ztluštělouepiteliální morfologii charakteristickou pro živočišnou destičku(obr. 4, srovnejte A,B s C,závorky). U některých partií embryí probíhala gastrulace normálně, i když se opožďovala, a poloha archenteronu ukazovala, že se vytvořila orální/aborální polarita (obr. 4A). V jiných partiích většina embryí exogastrulovala. U embryí, která postrádala Six3, byla neurální diferenciace silně inhibována, jak bylo zjištěno pomocí imunoznačení neurálních markerů normálně exprimovaných během stádií lategastrula a pluteus (obr. 4, porovnejte A,B s C). Většina (2/3) embryí obsahovala noserotonergní neurony a zbytek měl snížený počet (obr. 4D) ve srovnání s normálním počtem v tomto stadiu (3-5). Totéž platilo pro všechny ostatní neurony,testované pomocí panneurálního markeru synaptotagminu (1e11)(obr. 4A,B), které se nacházejív APD a řasinkovém pásu normálních třídenních embryí(obr. 4C). Významné je, že exprese hbn byla snížena na úroveň nedetekovatelnou in situ hybridizací (obr. 4F versus obr. 4E). Měření QPCRpotvrdilo toto pozorování a ukázalo, že hladiny obou mRNA hbn afoxq2, které označují vnější hranice, respektive vnitřní části APD, byly u morfantů Six3 ve stádiu blastuly (Obr. 5) sníženy 8 až 10krát.

Temporální profily exprese genů v prozatímní časné skupině APD. Metody profilování byly popsány v práci Wei et al (Wei et al., 2006). Hodnoty v různých hodinách po oplození od 2 do 72 jsou uvedeny jako procento maximální intenzity signálu pro každý gen u 2buněčné (mateřská RNA), 15hodinové blastuly (EB), 30hodinové pozdní mezenchymové blastuly (LMB), 48hodinové lategastruly (LG) a 72hodinové pluteální larvy (PL). Profily jsou seskupeny podle doby nejčasnější detekovatelné exprese: (A) mateřská; (B,C) časná blastula; (D) časná blastula až mezenchymová blastula. Poloha přerušované čáry představuje čas provedení testu u Six3morfantů. Data pro gen Six3 jsou zvýrazněna červenou šipkou.

Six3 je vyžadován pro expresi většiny genů v sadě E-APD

Nápadný fenotyp způsobený ztrátou genu Six3, stejně jako jeho časná exprese v embryu, naznačují, že by mohl fungovat blízko vrcholu regulační sítě genůAPD. Abychom tuto možnost dále prozkoumali, použili jsme analýzu mikročipů k hledání genů závislých na Six3 ve 27 hodinách, tedy v době, kdy geny v sadě E-APD dosahují maximální úrovně exprese. Abychom vyloučili endomesodermální funkce Six3, provedli jsme tento screening u embryí s injekcíΔkadherinu. Jak ukazuje obr. 5A, ztráta Six3 v těchto embryích zcela eliminovala vývoj všech nadbytečných neuronů nalezených v embryích s Δkadherinem a nevytvořil se žádný ztluštělý epitel, což opět dokazuje důležitou roli Six3 ve vývoji APD. Mikroarraydata identifikovala překvapivě velký počet genových predikcí (682), které byly silně downregulovány (nejméně čtyřnásobně) u embryí s dvojitou injekcí mRNAΔkadherinu a Six3-MO ve srovnání s embryi, kterým byla injekčně podána pouze mRNAΔkadherinu. Kromě toho bylo více než 60 % všech genů vpředchozím screeningu mikročipů, které byly u embryí s mRNAΔkadherinu regulovány alespoň trojnásobně, a tedy pravděpodobně exprimovány v APD, významně sníženo ztrátou Six3. Důležité je, že data z mikročipů ukázala, že většina genů E-APD byla citlivá na Six3 (obr. 5B, žlutá barva). V dobré shodě s tím měření QPCR ve dvou dalších partiích embryí ukázala, že pouze 5 genů E-APD nebylo významně závislých na Six3 (obr. 5B, červená, modrá).

Nadměrná exprese Six3 je dostatečná k rozšíření APD

Tyto výsledky silně podporují myšlenku, že Six3 funguje v časných fázích regulačních sítí APDgenů, a zvyšují možnost, že by mohl být dostatečný k tomu, aby indukoval další buňky v embryu k přijetí APD osudu.Misexprese Six3 vedla k embryím vykazujícím mimořádnou změnu morfologie. Podkovovitý pruh hustě zabalených buněk se táhl ve vegetativním směru od živočišného pólu (obr. 6, srovnej B,C s A). serotoninergní neurony, normálně omezené na živočišnou destičku (obr. 6D), se čtyřnásobně zvětšily a byly rozmístěny podél hustého pruhu (obr. 6G). Kromě toho jsou sloupcové tvary a uspořádání nervových výběžků v buňkách obsahujících synaptotagmin (1e11) podobné jako v živočišné destičce kontrolních embryí (obr. 6E, bílý čárkovaný rámeček oproti obr. 6H). Všechny tyto buňky obsahují ve svých jádrech NK2.1 (obr. 6J-M, zeleně), transkripční faktor normálně exprimovaný v živočišné destičce a přilehlémupraorálním ektodermu (obr. 6I, I′; zelené kroužky na obr. 6U), stejně jako několik buněk v předním střevě (Takacs et al.,2004). Řetězec 1e11-pozitivních neurálních buněk protíná pás(obr. 6K, červeně) a buňky na spodní straně NK2.1-pozitivního pásu rovněž exprimují Gsc(obr. 6L,N, červeně). Kombinace NK2.1 a Gsc jednoznačně označuje supraorální obličejový epitel na orálním okraji zvířecí desky (obr. 6I, I′, žluté buňky a obr. 6U, žluté kroužky). Hustě uspořádané sloupcovité buňky rozšířeného pásu obklopují ploššíepiteliální buňky, které exprimují NK2.1, ale ne Gsc(obr. 6M,N), stejně jako buňky horních oblastí úst normálních embryí(obr. 6I, ústa, m). Dalším důkazem, že tyto buňky jsou podobné buňkám v blízkosti úst normálních embryí, je to, že exprimují mRNA hbn, která se u normálních třídenních embryí hromadí kolem okraje zvířecí ploténky a zasahuje do nadústního ektodermu (obr. 1, obr. 6O). U embryí exprimujících Six3 jsou hbn pozitivní buňky soustředěny v tenkém epitelu na vegetativním pólu a nacházejí se tak ve stejné poloze vzhledem k rozšířené živočišné destičce a Nk2.1 pozitivním buňkám v horní části předního střeva jako u normálních embryí (obr. 6P,Q). Strana naproti orální oblasti se diferencuje jako tenký skvamózní epitel, exprimuje marker aborálního ektodermu Spec1 (obr. 6R-T) a může odpovídat hbn pozitivnímu pruhu aborálního ektodermu přiléhajícímu k živočišné desce. Souhrnně tyto vzorce genové exprese vedou k pozoruhodnému závěru, že Six3 stačí k nové specifikaci osudů buněk ve většině zbytku embrya, čímž vzniká třídenní embryo sestávající ze značně rozšířené, ale správně modelované domény animal pole s orální/aborální polaritou. APD u normálních embryí a embryí exprimujících Six3 je na obr. 6U vyznačena modrými kroužky.

Protože chybně exprimovaný Six3 může rozšiřovat celou APD a podporovat vývoj ektopických neuronů, ptali jsme se, které geny v sadě genů E-APD jsou regulovány, pomocí měření microarray a QPCR.Tabulka 2 uvádí 10 takových genů, jejichž hladiny mRNA jsou u embryí s injikovanou mRNA Six3 zvýšeny nejméně 3krát.

Six3 může potlačit signalizaci TGF-β, ale neeliminuje orální/aborální polaritu

Misexprese Six3 neeliminuje orální/aborální polaritu, protože markery orálního a aborálního ektodermu jsou exprimovány na opačných stranách embrya a neurony, které se normálně nacházejí v APD, jsou omezeny na intervenční pás.Misexprese Six3 však snižuje expresi nodálních i levých a chordinových znaků v mezenchymových blastulách (tabulka 3, vlevo), možná proto, že Six3 poskytuje pozitivní vstup do exprese FoxQ2, u něhož bylo prokázáno, že potlačuje nodální expresi (Yaguchi a kol.), Překvapivě Six3 nepotlačuje akumulaci mRNA bmp2/4 tolik, jako snižuje nodální, ačkoli exprese bmp2/4 vyžaduje u normálních embryí nodální funkci (Duboc et al., 2004). Tento zdánlivý paradox může být důsledkem kombinace snížené inhibice signalizace BMP2/4 zprostředkované Chordinem v kombinaci s difuzí BMP2/4 a následnouutoaktivací, jak bylo prokázáno v jiných systémech(Biehs et al., 1996;Jones et al., 1992).

Kanonické signály Wnt, nikoli TGF-β, brání expanzi APD do bočního ektodermu

Signály, které vymezují APD, závisí na kanonické signalizaci Wnt, protože její eliminace umožňuje, aby APD zahrnovala téměř celé embryo(Yaguchi et al., 2006)(obr. 1). Protože Nodal a BMP závisí na kanonických signálech Wnt, eliminovali jsme oba ligandy TGF-β pomocí Nodal-MO (Yaguchi et al.,2008), abychom otestovali, zda jsou zodpovědné za omezení APD v závislosti na Wnt. Obr. 7B,F ukazují, že tomu tak není, protože serotonergní neurony zůstávají u těchto embryí omezeny na APD. Když však morfantům Nodal dodáme exogenní Six3, pak se počet serotoninergních neuronů výrazně zvýší a objeví se v celé zvířecí polovině embrya(obr. 7D), jak je pozorováno u embryí exprimujícíchΔcadherin(Yaguchi et al., 2006), což znemožňuje kanonickou Wnt signalizaci. Proto může ektopická exprese Six3překrýt jiné signály, pravděpodobně Wnt, které omezují tyto neurony naAPD normálních embryí.

Ačkoli se serotonergní neurony v laterálním ektodermu u Nodalmorphantů netvoří, některé neserotonergní neurony ano(obr. 7B). To je důsledkempředevším, ne-li výhradně, ztráty signalizace BMP2/4, protože stejnéhovýsledku je dosaženo u embryí s injekcí BMP2/4-MO (S.Y., J.Y., L.M.A., R.C.Aand R. D. Burke, nepublikováno). Protože vývoj všech neuronů v normálním embryu závisí naSix3, položili jsme si otázku, zda ektopické neurony u Nodalmorphantů závisí také na Six3, a to současnou injekcí Nodal-MO a Six3-MO. Jak se očekávalo, serotonergní neurony přítomné na zvířecím pólu u Nodalmorphantů byly u dvojitých morfantů ztraceny (obr. 7G,H). Tato embrya neobsahují diferencované neserotonergní neurony s axonálními výběžky, ačkoli byla pozorována některá 1e11-imunoreaktivní místa. Ty mohou naznačovat přítomnost neúplně diferencovaných neuronů nebo odrážet iniciálníneurální tendenci buněk ektodermu, která je normálně překonána signalizací TGF-β.

Six3 může antagonizovat Wnt signalizaci

Fakta, že APD se nerozšiřuje u morfantů Nodal, ale rozšiřuje se u embryí injikovanýchΔcadherinem, a že Six3 může překonat kanonickéWnt-dependentní účinky v laterálním ektodermu, zvyšují možnost, že Six3 potlačuje Wnt signalizaci. Na podporu této hypotézy jsme zjistili, že Six3misexprese downreguluje většinu genů kódujících Wnt ligandy, které jsouexprimovány během časného vývoje (tabulka 3, vlevo) (obr. 8). jedním z nich je Wnt8, klíčový vegetativní signál potřebný pro normální vývojendomesodermu (Wikramanayake etal., 2004), což je výsledek, který je v souladu s nedostatečným vegetativním vývojem u embryí s Six3misexpresí. Souhrnně tyto výsledky naznačují, že hranice APD jsou určeny antagonismem Six3/Wnt.

Six3 nestačí k potlačení exprese wnt a nodal v APD

Schopnost Six3 silně downregulovat (přímo nebo nepřímo) geny kódující ligandy Wnt, stejně jako nodal, lefty a chordin,zvyšuje možnost, že normálně zabraňuje expresi těchto genů v APD. Abychom to vyhodnotili, zkoumali jsme nejprve účinky Six3 na expresi genů v embryích s injekcí Δcadherinu, abychom vyloučili možné protichůdné účinky funkce Six3 v endomesodermu. Údaje z microarray i QPCR ukazují, že u embryí tvořených převážně APD Six3potlačuje expresi genů Wnt a nodálních, levotočivých achordinových genů (tab. 3;obr. 8). U normálních embryí (s glycerolovou injekcí) však represi těchto genů Six3 nelze zjistit(tab. 3;obr. 8), což naznačuje, žedodatečné mechanismy chrání APD před expresí Wnt a TGF-β v normálním embryu.

Regulace Six3 jiných signálních drah

Six3 také pozitivně reguluje (buď přímo, nebo nepřímo) geny kódující proteiny, které fungují v jiných signálních drahách(tab. 3). Patří mezi něelta, ligand Notch, který zprostředkovává laterální inhibici, klíčovýproces v nervovém vývoji, stejně jako další potenciální regulátoryneurogeneze. K těm posledním patří fgf9/16/20, fgfr podobný, membránově vázaný receptor postrádající tyrozinkinázovou doménu, a frizzled5/8, Wnt receptor, který může přenášet nekanonické signály, ale jehož funkce v APD není známa (Croce etal., 2006). Budoucí studie budou zkoumat, jak aktivitytěchto signálních drah a časných transkripčních faktorů závislých na Six3interagují v regulační síti genů APD.