Je všeobecně známo, že přírodní a dietní antioxidanty hrají zásadní roli v prevenci různých onemocnění způsobených oxidačním stresem. Oxidační stres ovlivňuje riziko CVD, včetně aterosklerózy, prostřednictvím zastavení produkce volných radikálů a procesu oxidace LDL (Kovanen a Pentikäinen, 2003). Reaktivní formy kyslíku (ROS) vedou k produkci a hromadění oxidovaných LDL v místě aterosklerotických lézí (Yla-Herttuala, 1999). Oxidační stres také postupně vede k rozvoji aterosklerózy tím, že přispívá k tvorbě pěnových buněk makrofágů a způsobuje endoteliální dysfunkci (Mietus-Snyder et al., 2000). Bylo zjištěno, že RS významně snižuje markery oxidačního stresu včetně glykovaného albuminu v séru a 8-hydroxyguanosinu v moči u spontánně hypertenzních potkanů náchylných k mrtvici (Mizutani et al., 2001). RS také zvyšuje aktivitu katalázy a snižuje produkci ROS v srdeční tkáni morčat (Floreani et al., 2003). Rocha et al (2009) prokázali snížení oxidovaných LDL u potkanů krmených dietou s vysokým obsahem tuku, kterým byl RS podáván po dobu 45 dnů v dávce 1 mg/kg denně. Všechny výše uvedené výsledky naznačují, že RS účinně inhibuje peroxidaci lipidů in vivo. Antioxidační vlastnosti RS byly navrženy jako mechanismus, který je základem jeho rozmanitých účinků včetně antiaterogenních účinků (Fremont, 2000).
Inhibiční účinek RS na produkci ROS a peroxidaci lipidů
V mnoha studiích se uvádí, že RS inhibuje oxidační stres tím, že vychytává ROS a tlumí peroxylové radikály a peroxid vodíku (Jang a Surh, 2001; Liu et al., 2003; Shigematsu a kol., 2003; Chen a kol., 2004; Leiro a kol., 2004). Inhibice intracelulární i extracelulární produkce ROS pomocí RS byla prokázána při koncentraci od 1 do 100 μmol/l (Jang a Surh, 2001). RS prokázal silné antioxidační vlastnosti tím, že snižuje rychlost oxidace cytochromu C hydroxylovými radikály, které vznikají působením ultrafialového záření peroxidu vodíku (H2O2) (Turrens a kol., 1997). Ukázalo se také, že RS vychytává hydroxylové radikály (Soares et al., 2003) a inhibuje superoxidový radikál a H2O2 produkované makrofágy stimulovanými lipopolysacharidy (LPS) nebo estery fosforu. RS účinně snižuje uvolňování kyseliny 3H-arachidonové vyvolané LPS, estery fosforu nebo působením superoxidu či H2O2 (Martinez a Moreno, 2000) a významně snižuje hladiny thiolových proteinů v krevních destičkách izolovaných od lidí (Olas et al., 2004). Leonard et al. (2003) prokázali, že RS je silný antioxidant tím, že vychytává hydroxylové a superoxidové radikály a chrání buňky tím, že zabraňuje peroxidaci lipidů v buněčných membránách i poškození DNA. Bylo prokázáno, že RS zabraňuje peroxidaci lipidů a inhibuje vychytávání oxidovaných LDL (Fremont et al., 1999; Leighton et al., 1999; Bhavnani et al., 2001). Tato inhibice peroxidace lipidů RS by mohla vyplývat ze silného antioxidačního účinku RS a jeho schopnosti inhibovat tvorbu ROS (Fremont et al., 1999; Olas a Wachowicz, 2002).
Oxidace LDL cholesterolu je silně spojena s rizikem KVO (Holvoet, 2004). V jaterních mikrosomech potkanů inhiboval RS peroxidaci lipidů vyvolanou železem i ultrafialovým zářením a zabránil oxidaci LDL mědí (Fauconneau et al., 1997; Miura et al., 2000). RS mohl účinně zabránit oxidační modifikaci LDL inhibicí aktivity enzymu lipoxygenázy (Maccarrone et al., 1999; Kovanen a Pentikäinen, 2003). Bylo zjištěno, že polyfenoly v červeném víně včetně RS inhibují oxidaci LDL; tento účinek byl silnější než u známého antioxidantu α-tokoferolu (Frankel et al., 1993). RS také zabraňuje oxidaci polynenasycených mastných kyselin obsažených v LDL (Miller a Rice-Evans, 1995) a inhibuje vychytávání oxidovaných LDL v cévní stěně v závislosti na koncentraci (Fremont, 2000) a také zabraňuje poškození lipidů způsobenému peroxidací (Frankel a Waterhouse, 1993; Leighton et al.),
RS potlačuje oxidační stres zvýšením syntézy oxidu dusnatého v ischemicky reperfundovaných tkáních (Hattori et al., 2002). Bylo prokázáno, že RS zabraňuje produkci ROS stimulované LPS (Martinez a Moreno, 2000) a inhibuje ROS a peroxidaci lipidů indukovanou tumor nekrotizujícím faktorem (TNF) v široké škále buněk včetně myeloidních, lymfoidních a epiteliálních buněk (Manna a kol., 2000). RS inhibuje peroxidaci lipidů tím, že účinně vychytává různé volné radikály včetně peroxylových a hydroxylových radikálů v postischemickém reperfundovaném myokardu (Ray et al., 1999). Po léčbě RS byla rovněž pozorována inhibice inducibilní syntázy oxidu dusnatého a prevence cytotoxických účinků (Tsai et al., 1999; Matsuda et al., 2000).
Bradamante et al. (2004) podrobně vysvětlili mechanismus účinku RS při inhibici peroxidace lipidů. Navrhují různé mechanismy, kterými RS působí antioxidačně (Zini et al., 1999). Za prvé, RS může soutěžit s koenzymem Q a snižuje komplex III oxidačního řetězce. Za druhé bylo zjištěno, že RS zvyšuje intracelulární glutathion, který zachycuje volné radikály, protože RS udržuje životaschopnost buněk a inhibuje oxidaci (Savaskan et al., 2003). Zatřetí, RS může zvýšit množství endogenních antioxidantů a enzymů fáze 2 v kardiomyocytech a tato zvýšená buněčná obranyschopnost poskytuje ochranu před oxidačním poškozením (Cao a Li, 2004). RS a jeho analogy se ukázaly jako účinné antioxidanty proti peroxidaci kyseliny linolové v micelách dodecylsulfátu sodného a cetyltrimethylamoniumbromidu (Fang et al., 2002; Fang a Zhou, 2008). Výsledky naznačují, že antioxidační účinky zahrnují zachycení šířících se peroxylových radikálů na povrchu micel a regeneraci α-tokoferolu.
Modulace antioxidačních enzymů pomocí RS
Zjistilo se, že léčba RS snižuje oxidační stres a zabraňuje různým onemocněním tím, že zvyšuje aktivitu několika antioxidačních enzymů včetně superoxiddismutázy, katalázy, glutathionu, glutathionreduktázy, glutathionperoxidázy a glutathion-S-transferázy v buňkách hladkého svalstva potkaní aorty (Yen et al..), 2003; Li et al., 2006). Bylo prokázáno, že RS udržuje hladinu glutathionu v oxidačně stresovaných lidských mononukleárních buňkách periferní krve a zvyšuje hladinu glutathionu v lidských lymfocytech aktivovaných peroxidem vodíku (Losa, 2003; Olas et al., 2004). Byla prokázána silná indukce enzymů fáze II metabolizujících léčiva a antioxidačních genů v závislosti na dávce, když se potkanům podávalo 0,3, 1 a 3 g/kg tělesné hmotnosti RS denně po dobu 28 dnů (Hebbar et al., 2005). Významné snížení oxidačního stresu po léčbě RS snížením lipidového hydroperoxidu a zvýšením antioxidačních enzymů včetně superoxiddismutázy u potkanů krmených dietou s vysokým obsahem tuku prokázali Rocha et al. (2009).
Protizánětlivé účinky RS
Úloha zánětu v procesu aterosklerózy je v posledním desetiletí stále více uznávána. Zánět hraje významnou roli ve všech fázích aterosklerózy včetně iniciace, progrese a tvorby plaku. (Libby et al., 2002; Jawien, 2008). Byly navrženy protizánětlivé účinky RS in vivo i in vitro a základní mechanismus (Udenigwe et al., 2008). RS inhibuje aktivitu cyklooxygenázy-2, což je enzym produkující PGE2, důležitou složku pro zprostředkování zánětu (Donnelly et al., 2004). Interleukin-6 je považován za důležitý marker v procesu zánětu a progrese aterosklerotických plátů (Ikeda et al., 2001). Bylo prokázáno, že kultivované myší makrofágy po léčbě RS snižují genovou expresi, syntézu a sekreci interleukinu-6 (Zhong et al., 1999). Bylo zjištěno, že RS potlačuje zánětlivý proces prostřednictvím zprostředkování různých zánětlivých markerů, jako je inhibice sekrece interleukinu-8 a faktorů stimulujících kolonie granulocytárních makrofágů (Culpitt et al., 2003; Donnelly et al., 2004), endoteliálně-leukocytárních adhezních molekul, vaskulární buněčné adhezní molekuly-1 a inhibicí sekrece histaminu a tumor nekrotizujícího faktoru-α (Carluccio et al., 2003).
Zdá se, že k inhibici angiogeneze indukované vaskulárním endoteliálním růstovým faktorem dochází narušením RS dráhy závislé na ROS v endoteliálních buňkách lidské pupečníkové žíly. (Lin et al., 2003). Snížení prozánětlivého cytokinu tumor nekrotizujícího faktoru-α prokázali také Rivera et al. (2009) po léčbě Zuckerových potkanů RS v dávce 10 mg/kg tělesné hmotnosti po dobu 8 týdnů. Pervaiz (2003) prokázal vliv RS na účinek nukleárního faktoru-κB, důležitého transkripčního faktoru, který reguluje různé mediátory nebo zánět včetně cytokinů, růstových faktorů a adhezních molekul. RS má silný protizánětlivý účinek tím, že inhibuje adhezi leukocytů na modelu ischemie-reperfuze u potkanů v dávce 0,7 mg/kg (Shigematsu et al., 2003).
Důležitým rizikovým faktorem pro KVO je údajně také endoteliální dysfunkce (Rodriguez-Porcel et al., 2001). Fukuda et al (2006) zjistili, že RS významně zvyšuje angiogenezi myokardu u potkanů s experimentálním infarktem myokardu prostřednictvím mechanismu zprostředkovaného vaskulárním endoteliálním růstovým faktorem. Saiko et al. (2008) se zabývali příznivými účinky RS na metabolismus kyseliny arachidonové, kde bylo zjištěno, že RS inhibuje přeměnu fosfolipidů na kyselinu arachidonovou. Dále RS potlačuje zánět inhibicí cyklooxygenázy-1, -2; lipoxygenáz, epoxygenáz a syntézy prostaglandinů a eikosanoidů (Saiko et al., 2008). Hattori et al. (2002) a Hung et al. (2000) prokázali inhibici zánětu a tvorby ateromatózních plátů pomocí RS prostřednictvím změny tvorby oxidu dusnatého z cévního endotelu. RS moduluje produkci a sekreci zánětlivých mediátorů, a tím potlačuje trombogenní funkci polymorfonukleárních buněk (Rotondo et al., 1998).
Úloha RS na produkci vazodilatátorů a vazokonstriktorů
Je známo, že endotelové buňky regulují a udržují rovnováhu mezi vazodilatátory, jako je oxid dusnatý, a vazokonstriktory, jako je endotelin-1, a také snižují riziko aterosklerózy tím, že zabraňují aterogenezi (Davignon a Ganz, 2004). Uvádí se, že RS ovlivňuje a udržuje rovnováhu mezi produkcí vazodilatátorů, respektive vazokonstriktorů (Fan et al., 2008). Snížení produkce oxidu dusnatého vede k vazokonstrikci, agregaci destiček a oxidačnímu stresu. RS navíc inhibuje enzym cyklooxygenázu-1, který je silným vazokonstriktorem a má důležitou roli v agregaci destiček (Szewczuk et al., 2004). V endoteliálních buňkách plicní tepny byla při léčbě RS zjištěna zvýšená aktivita syntázy oxidu dusnatého, což svědčí o přímém podílu oxidu dusnatého na vazorelaxaci (Klinge et al., 2003). Bylo prokázáno, že RS zvyšuje expresi syntázy oxidu dusnatého, a tím potenciálně chrání perfundované pracovní srdce (Hattori et al., 2002), ačkoli RS nevykazoval takový ochranný účinek u myší s knockoutem syntázy oxidu dusnatého (Imamura et al., 2002). Tyto výsledky potvrzují účinek RS na vyvážení vazokonstriktorů a vazodilatátorů, čímž zabraňuje agregaci destiček a oxidačnímu stresu, což vede ke snížení rizika KVO.
Potlačení agregace destiček pomocí RS
Agregace destiček má důležitou roli při zprostředkování aterosklerózy, kdy destičky adherují k povrchu buněk, uvolňují růstový faktor odvozený od destiček a indukují aterosklerózu. Zvýšená nebo narušená agregace destiček má za následek různé komplikace včetně infarktu myokardu, ischemie a mozkové mrtvice. Bylo však prokázáno, že RS inhibuje agregaci krevních destiček (Bertelli et al., 1996b; Bhat et al., 2001; Fan et al., 2008). Bylo také prokázáno potlačení agregace trombocytů pomocí RS u králíků s hypercholesterolemickou dietou a snížení aterosklerózy u geneticky hypercholesterolemických myší (Zini et al., 1999; Wang et al., 2002b). V plné krvi však RS takové účinky neprokázal, protože mechanismus by mohl spočívat v inhibici mitogenem aktivovaných proteinkináz v krevních destičkách (Kirk et al., 2000). Bylo prokázáno, že různé mechanismy účinku RS inhibují agregaci destiček, včetně inhibice adheze destiček ke kolagenu typu I, což je hlavní krok aktivace destiček. Olas et al (2002) prokázali, že předběžné ošetření destiček RS zabraňuje adhezi destiček ke kolagenu a fibrinogenu stimulované LPS nebo trombinem. Tato zjištění poskytují více informací o supresivním účinku RS na agregaci trombocytů.
Aspekty bezpečnosti léčby RS
Několik studií s lidmi a různými zvířecími modely prokázalo absenci významných toxických účinků po suplementaci RS v širokém rozsahu dávek. U potkanů nebyly zjištěny žádné toxické účinky po perorálním podávání dávky 20 mg/kg denně po dobu 28 dnů (Juan et al., 2002). Dávky použité v těchto studiích byly 1000krát vyšší než množství, které konzumují lidé pijící jednu sklenici červeného vína denně. Kromě toho nebyly pozorovány žádné nežádoucí účinky u potkanů, kterým bylo podáváno RS v dávce 300 mg denně po dobu 4 týdnů (Crowell et al., 2004). Boocock et al (2007) nezaznamenali žádnou toxicitu u lidí, kterým byla podána jednorázová dávka RS až 5 g. Výsledky těchto studií signalizují, že RS lze konzumovat pro jeho příznivé účinky bez zjevné toxicity.