Antiglykemický účinek vodou extrahovatelného arabinoxylanu z pšeničného aleuronu a otrub

Abstrakt

Studie účinků polysacharidů arabinoxylanu (AX) na postprandiální reakci glukózy přinesly vzhledem k různorodosti struktur AX protichůdné výsledky. Čtyři vodou extrahovatelné extrakty AX (WEAX) získané z aleuronu a otrub pšenice byly použity ke zkoumání a) vlivu AX na aktivity α-amylázy a α-glukosidázy, b) vlivu chemického složení AX na jejich inhibiční účinnost a c) kinetiky inhibice enzymů. Aktivita α-amylázy nebyla přítomností frakcí WEAX významně ovlivněna bez ohledu na typ nebo koncentraci. WEAX inhiboval aktivitu α-glukosidázy pouze v případě, že jako substrát byla použita maltóza, ale nikoli sacharóza. Hodnoty IC50 WEAX (- mg/ml) silně korelovaly s obsahem kyseliny ferulové (), poměrem arabinózy a xylózy () a relativním podílem nesubstituované (), disubstituované () a monosubstituované () xylózy. Lineweaverův-Burkův graf naznačil nekompetitivní způsob inhibice enzymu. Naše výsledky tedy naznačují, že antiglykemické vlastnosti přípravku WEAX mohou být odvozeny od přímé inhibice aktivity α-glukosidasy.

1. Úvod

Prevalence diabetu 2. typu celosvětově stoupá. Diabetes je chronické onemocnění, jehož příznakem je vysoká cirkulující plazmatická glukóza. V prevenci a léčbě pacientů s diabetem 2. typu má proto zásadní význam řízení postprandiální glykemie. Intervenční studie na lidech ukázaly, že konzumace stravy bohaté na arabinoxylan (AX) snižuje postprandiální hladinu glukózy v krvi u zdravých osob, osob s poruchou glukózové tolerance a diabetiků . Naproti tomu Mohlig a spolupracovníci nezjistili žádný vliv na odezvu glukózy, když byly zdravým lidem podávány housky doplněné AX. Studie na zvířatech rovněž uvádějí smíšené výsledky ohledně účinku suplementace AX . Základní mechanismy zůstávají nejasné, ale předpokládá se, že rozpustné vlákniny zvyšují viskozitu lumen a tím zpomalují vstřebávání živin . Zdánlivá viskozita roztoků AX je ovlivněna asymetrickou konformací a molekulovou hmotností AX a také koncentrací polymeru . Zdá se, že z těchto tří faktorů ovlivňuje viskozitu nejvíce koncentrace AX . Účinek AX na hladinu glukózy v krvi je tedy závislý na dávce. Zdánlivá viskozita roztoků AX je také závislá na smykovém napětí, takže vyšší smyk vede ke smykovému zřeďování, což je chování charakteristické pro nenewtonské kapaliny . Nedávné studie naznačují, že viskozitní účinek AX může být kompenzován silnou střevní peristaltikou .

Molekulární struktura AX je složitá a heterogenní. AX se skládají z xylanové páteře tvořené () navázanými β-D-xylopyranosylovými (Xylp) zbytky s α-L-arabinofuranosylovými (Araf) zbytky navázanými na xylanovou páteř v polohách C(O)-2 a C(O)-3 a/nebo v obou polohách C(O)-2 a C(O)-3 . Xylosové zbytky mohou být také substituovány vazbami kyseliny glukuronové a/nebo methylglukuronové . Zbytky kyseliny ferulové nebo kumarinové jsou esterově vázány na zbytky arabinosy v poloze C(O)-5 . Poměr arabinózy ke xylóze, způsob substituce arabinózy, stupeň feruloylace a molekulová hmotnost se mezi obilnými zrny i v rámci nich značně liší . Arabinoxylány (AX) tvoří nejvyšší podíl vlákniny v zrnech obilovin (60-70 %) a jejich obsah se liší podle zdroje nebo frakce zrna. AX tvoří 1,3-2,7 % hm. pšenice . Aleuron a perikarp pšenice obsahují 20, resp. 45 % AX . Velká část AX v pšenici je nerozpustná ve vodě (70-86 %) .

Sacharidy stravitelné v potravě jsou před vstřebáním v gastrointestinálním traktu hydrolyzovány na monomerní cukry, glukózu nebo fruktózu . Škrob je tráven především na maltózu a další sacharidy s krátkým řetězcem slinnou a pankreatickou amylázou. Vzniklé (maltóza, maltotrióza a α-limitní dextriny) a sacharóza jsou štěpeny na glukózu nebo fruktózu α-glukosidázami na hranici tenkého střeva (maltáza-glukoamyláza a sacharáza-izomaltáza) . Na vstřebávání cukrů v tenkém střevě se podílejí především transportéry GLUT2, GLUT5 a SGLT1 . Snížení postprandiální hyperglykémie lze tedy dosáhnout omezením střevního trávení nebo absorpce sacharidů. Navzdory obrovským rozdílům ve struktuře AX většina studií uvádí jen velmi málo nebo vůbec žádné podrobnosti o složení nebo struktuře použitých AX, což ztěžuje porovnání výsledků o účinku AX na postprandiální glykemii . Existují také velmi omezené údaje o účinku AX extrahovatelných z čištěné vody na enzymy trávení sacharidů. V této studii jsme se proto zaměřili na zkoumání (a) účinku AX na aktivity α-amylasy a α-glukosidasy, (b) vlivu chemického složení AX na jejich inhibiční účinnost a (c) kinetiky inhibice enzymů.

2. Materiál a metody

2.1. Inhibiční účinek AX na aktivity α-amylasy a α-glukosidasy. Chemické látky a činidla

Komerční pšeničný aleuron (Grainwise wheat aleurone) byl darem od společností Cargill Limited a Horizon Milling (Wichita, Kansas, USA). Obsahuje 4,5 % lipidů, 15,2 % bílkovin, 7,4 % popela a 2,5 % škrobu. Otruby z tvrdé červené pšenice ozimé byly zakoupeny na místě od společnosti Bulk Barn (Winnipeg, Manitoba, Kanada). Obsah vlhkosti, popela a bílkovin byl analyzován na 5,8 %, 5,3 % a 11,1 %. Pšeničný nemodifikovaný škrob, maltóza, sacharóza, akarbóza, α-amyláza z prasečí slinivky (EC 3.2.1.1, typ VI-B), amyloglukosidáza (EC 3.2.1.3) z aspergilů a střevní acetonový prášek z potkana byly zakoupeny od firmy Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Síran amonný, všechny kyseliny a organická rozpouštědla byly zakoupeny od společnosti Fischer Scientific (Whitby, Ontario, Kanada). Souprava pro stanovení maltózy, sacharózy a glukózy (K-MASUG 08/13) byla zakoupena od společnosti Megazyme International Ireland (Bray, Wicklow, Irsko). Všechny použité chemikálie byly analytické nebo HPLC kvality

2.2. Příprava arabinoxylánu extrahovatelného vodou

Endogenní enzymy byly inaktivovány vařením vzorků pšeničných otrub a pšeničného aleuronu (~200 g) ve 2 l vodného ethanolu (80 %, v/v) při 85 °C pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin. Supernatant byl zlikvidován a zbytek byl přes noc sušen na vzduchu v digestoři při pokojové teplotě. Frakce extrahovatelné vodou byly izolovány ze vzduchem sušených otrub nebo aleuronu (150 g) při 45 °C podle metody popsané Izydorczykem a Biliaderisem. Vodný extrakt byl destarchizován pomocí α-amylázy (1821 U/l) a deproteinizován celitem a fulvozemí. Vyčištěný materiál byl frakcionován odstupňovaným srážením síranu amonného (AS) a frakce byly získány při 50 a 75 % nasycení AS. Získaný materiál byl po dialýze (membrána s mezní hodnotou 12 kDa) po dobu 48 hodin vysušen mrazem. Vodou extrahovatelné frakce získané z aleuronu pšenice byly označeny (WA) a následně koncentrací AS, při které byly získány (WA-f50 a WA-f75). Podobně byly odebrané materiály z pšeničných otrub (WB) označeny jako WB-f50 a WB-f75. Chemický a strukturní popis frakcí WEAX je uveden v tabulce 1.

2.3. Chemické složení a vlastnosti pšeničného aleuronu (WA) a pšeničných otrub (WB). Inhibiční test aktivity α-amylázy

Pšeničný škrob (300 mg) byl suspendován v 15 ml fosforečnanového pufru sodného (pH 6,9, 0,1 M) obsahujícího 1 mM chloridu vápenatého a vařen při 95 °C po dobu 15 minut . Frakce WEAX (40 mg) byly rozpuštěny ve 2 ml fosforečnanového pufru sodného. Vzorky byly naředěny tak, aby konečná koncentrace v reakční směsi byla 0,0, 0,2, 0,3 a 0,5 % (w/v). Stejné objemy (200 μl) škrobu a WEAXu (nebo kontroly) byly smíchány a promíchány. Hydrolýza škrobu byla zahájena přidáním 70 μl prasečí pankreatické α-amylázy (130 U/ml) a 40 μl houbové amyloglukosidázy (240 U/ml). Reakce byla po 30 minutách zastavena zahříváním při 95 °C po dobu 5 minut. Směs byla okamžitě zchlazena na ledu a odstředěna (Thermo Scientific, Sorvall Legend Micro21, Německo). Supernatanty byly odebrány a analyzovány na glukózu pomocí glukózové testovací soupravy Megazyme. Studie intervence na lidech uvádějí účinnost koncentrace 0,25 až 0,70 % AX, a proto jsme zvolili koncentrační rozmezí.

2,4 . Inhibiční test aktivity krysí střevní α-glukosidázy

S úpravami byla použita metoda inhibice α-glukosidázy podle Okiho et al. Stručně řečeno, prášek acetonu ze střeva potkana (500 mg) byl smíchán s 10 ml fosforečnanového pufru sodného (pH 6,9, 0,1 M) a sonikován v ledové lázni po dobu 30 sekund (12krát) s 15sekundovou přestávkou, aby se zabránilo nahromadění tepla. Směs byla později odstředěna při 10000 při 4 °C po dobu 10 minut. Supernatant byl odebrán a označen jako krysí střevní α-glukosidasa. Vzorky WEAX (40 mg) byly rozpuštěny ve 2 ml fosforečnanového pufru sodného (pH 6,9, 0,1 M). Později bylo 50 μl potkaní střevní α-glukosidasy smícháno se 100 μl vzorku nebo pufru (kontrola) a inkubováno při 37 °C po dobu 5 minut. Přidalo se 50 μl 20 mM sacharózy nebo 4 mM maltózy a dále se inkubovalo 60 minut (sacharóza) nebo 30 minut (maltóza). Konečná koncentrace frakce WEAX byla 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 a 0,0 % (w/v). Aktivita enzymu byla zastavena zahřátím na 95 °C po dobu 10 minut. Po odstředění při 10000 po dobu 10 minut byly supernatanty odebrány pro analýzu glukózy pomocí testovací soupravy Megazyme GOPOD glucose. Inhibice alfa-glukosidázy (sacharázy nebo maltasy) v % byla vypočtena jako . Hodnota IC50 byla určena z grafu % inhibice α-glukosidázy v závislosti na koncentraci vzorku. Pro srovnání byla provedena také inhibice potkaní střevní α-glukosidázy akarbosou (známým inhibitorem α-glukosidázy). Místo vzorku byly použity koncentrace akarbosy 1,625, 3,25, 4,9, 6,5, 9,8 a 13 μg/ml.

2,5 . Statistická analýza

Všechny analýzy byly provedeny v sextuplikátu (pokud není uvedeno jinak) a všechny statistiky byly vypočteny pomocí jednocestné analýzy rozptylu (ANOVA) na statistickém softwaru JMP 12 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Průměry vzorků byly porovnány pomocí metody Tukey HSD a významné rozdíly byly stanoveny při . Korelace mezi jednotlivými parametry byly vypočteny pomocí Pearsonova korelačního testu.

3. Výsledky a diskuse

Vliv WEAXu na hydrolýzu škrobu je uveden na obrázku 1. Porovnávali jsme množství glukózy uvolněné během 30 minut inkubace s α-amylázou v přítomnosti nebo nepřítomnosti frakcí WEAX. Přídavek frakcí WEAX numericky snížil množství produkované glukózy ve srovnání s kontrolní úpravou. Statistické porovnání skupin ošetření a kontroly však ukázalo, že průměrný rozdíl nebyl významný () pro WA-f50, WA-f75 a WB-f75 bez ohledu na koncentraci WEAX. Přítomnost 0,5 % WB-f50 vedla k významnému snížení amylolýzy ve srovnání s kontrolou (). Naše pozorování pro aktivitu alfa amylázy však kontrastovala s jinými zprávami v literatuře pravděpodobně v důsledku koncentrace a typu AX. Amylolýza škrobu byla prováděna v přítomnosti 1 a 2 % AX a použitá AX byla zbavena kyseliny ferulové . Použili jsme koncentrace AX (~5-10 g), které odpovídají koncentracím uváděným při tlumení postprandiální glykémie ve studiích na lidech .

Obrázek 1

Vliv vodou extrahovatelného arabinoxylanu na hydrolýzu škrobu.

Tabulka 2 ukazuje vliv WEAX na aktivitu α-glukosidázy v přítomnosti sacharózy nebo maltózy jako substrátu. Údaje jsou prezentovány jako IC50, což je koncentrace inhibitoru, která vede k 50% inhibici aktivity α-glukosidasy. Hodnoty IC50 se pohybovaly v rozmezí 4,88-10,14 mg/ml proti aktivitě α-glukosidasy s maltosou jako substrátem. Při použití sacharosy jako substrátu však nebyla pozorována žádná inhibice. Inhibiční účinnost WEAXu proti střevní maltáze byla 1000-2000krát nižší ve srovnání s akarbosou (pozitivní kontrola). Všeobecně se předpokládá, že viskozita může být příčinou účinku AX na postprandiální glukózu . Proto Vogel a spol. podávali potkanům modifikované pšeničné otruby AX, aby studovali vliv viskozity . Také inhibice střevní alfa-glukosidázy mono-/oligosacharidy AX souvisela s jejich částí kyseliny ferulové . Proto měly WA-f50 a WB-f75 výrazně odlišnou inhibiční účinnost vůči α-glukosidázové aktivitě, přestože měly podobný relativní podíl nesubstituovaných (un-Xylp), monosubstituovaných (2-Xylp nebo 3-Xylp) a disubstituovaných xylózových zbytků (2,3-Xylp) a stupeň substituce, ale odlišný obsah kyseliny ferulové.

Poměr arabinozy ke xylose je mírou stupně substituce (DS). Mezi DS a IC50 byl pozorován silný negativní lineární vztah ( = -0,67). To mohlo být důsledkem zvýšené rozpustnosti AX v důsledku vysokého DS. Zdá se tedy, že vysoce substituovaný WEAX má nižší hodnotu IC50 (vysoká inhibiční účinnost). Stejné pozorování bylo podpořeno negativním vztahem mezi inhibiční účinností a relativním podílem nesubstituovaných xylosových zbytků. Zdánlivý poměr di-Xylových a mono-Xylových zbytků se nezdál mít vliv, ale rozsah substituce xylosy vykazoval vliv. Je tedy pravděpodobné, že účinek na α-glukosidázovou aktivitu může pocházet z arabinózových zbytků WEAX. Existují zprávy o inhibici aktivity α-glukosidázy arabinózou . Pokusy o odstranění arabinosových zbytků z WEAXu pomocí arabinofuranosidasy nebyly úspěšné, aby se tato hypotéza prokázala. Zaznamenali jsme však, že mono-Xyl na C (O)-2 byl hlavním určujícím faktorem ve srovnání s mono-Xylem na C (O)-3, což naznačuje, že inhibiční účinnost přesahuje pouhou přítomnost arabinosového zbytku. Byla zjištěna silná korelace mezi mono-xylem na C (O)-2 a obsahem kyseliny ferulové ( = 0,99). Je tedy možné, že pozorovaný vliv DS mohl být odvozen od vlivu kyseliny ferulové.

K výpočtu zdánlivé maximální rychlosti () a Michaelis-Mentenovy konstanty () pro aktivitu α-glukosidázy na maltóze v přítomnosti a nepřítomnosti WEAXu byl použit Lineweaver-Burkův graf (obr. 2). Vliv frakce WEAX na a byl analyzován za účelem určení typu inhibice. a α-glukosidázy pro maltózu v nepřítomnosti frakce WEAX byly 17,5 μg glukózy za minutu a 5,99 mM. Tabulka 4 ukazuje, že přídavek frakcí WEAX snížil obě hodnoty, což naznačuje, že WEAX inhiboval aktivitu α-glukosidázy nekompetitivním způsobem. Typickou vlastností nekompetitivní inhibice je, že v přítomnosti inhibitoru se obě a snižují. Je tedy pravděpodobné, že frakce WEAXu se vážou na enzymový substrátový komplex, čímž se snižují obě a . Bylo také zjištěno, že arabinosa inhibuje aktivitu α-glukosidasy nekompetitivním způsobem.

Obrázek 2

Lineweaver-Burkův graf inhibice potkaní střevní α-glukosidasy vodou extrahovatelným arabinoxylánem ().

Naše výsledky mohou poskytnout vysvětlení ohledně rozporů pozorovaných v literatuře ohledně vlivu AX na postprandiální hladinu glukózy. Krmení Zukerových diabetických potkanů chlebem s přídavkem AX (Ara/Xyl = 0,9) vedlo k významnému snížení postprandiální hladiny glukózy v krvi . Naproti tomu příjem nativního AX (Ara/Xyl = 0,5) neměl na reakci glukózy v krvi žádný vliv . Také suplementace stravy 6 a 12 g AX (Ara/Xyl = 0,66 nebo 0,8) snížila hladinu glukózy v krvi jak u zdravých, tak u diabetiků . AX (Ara/Xyl = 0,8) však neoslabil postprandiální odezvu glukózy u zdravých dospělých lidí . Prasata krmená bílým chlebem s přídavkem AX měla snížený čistý tok glukózy ve srovnání s prasaty krmenými bílým chlebem . Vzhledem k absenci podrobného chemického složení a struktury je obtížné porovnat výsledky o účinnosti AX . I když tedy koncentrace použitých AX mohou být stejné, jejich účinnost bude záviset na povaze použitých AX. Prokázali jsme, že AX získané při 50% nasycení síranem amonným vykazovaly vyšší inhibiční účinnost ve srovnání s AX získanými při 75% nasycení.

4. Závěr

Výsledky této studie naznačily, že antiglykemický účinek arabinoxylanů může být odvozen od inhibice aktivity střevní α-glukosidázy, ale nikoli aktivity amylázy. Účinnost vodou extrahovatelné AX na aktivitu α-glukosidázy byla ovlivněna poměrem obsahu kyseliny ferulové arabinózy ke xylóze a vzorem substituce xylózy. Zjištění také naznačují, že k inhibici aktivity α-glukosidasy dochází nekompetitivním mechanismem. Konzumace stravy bohaté na vodou extrahovatelné AX tak může tlumit postprandiální hladinu glukózy v krvi.

Zveřejnění

Část výsledků byla prezentována formou ústního posteru na konferenci Functional Foods and Natural Health Products Graduate Research (FFNHP) symposium/Therapeutic Applications of Functional Foods and Bioactives (TAFFB), která se konala ve výzkumném centru St-Boniface Hospital Albrechtsen Research Centre od 20. do 22. dubna 2016.

Střet zájmů

Všechny získané finanční prostředky nebo materiální podpora nevedly ke střetu zájmů při publikování tohoto rukopisu.

Poděkování

Tento výzkum byl financován Kanadskou radou pro přírodní a technický výzkum (NSERC) prostřednictvím programu Discovery Grant. Autoři rovněž děkují společnosti Cargill Limited za poskytnutí vzorků pšeničného aleuronu a Ce Zhouovi, Alison Serové a Pat Kenyonové z katedry potravinářských věd na University of Manitoba za technickou podporu.