Antioxidant enzymes, inflammatory indices and lifestyle factors in older men: a cohort analysis

Abstract

Zkoumali jsme vztah mezi aktivitou antioxidačních enzymů v krvi, ukazateli zánětlivého stavu a řadou faktorů životního stylu v Caerphilly prospective cohort study of ischaemic heart disease. Studie byla zahájena v roce 1979 a je založena na reprezentativním vzorku mužské populace. Zpočátku bylo ve fázi I sledováno 2512 mužů, kteří byli ve fázích II a III sledováni každých 5 let; nedávno byli sledováni ve fázi IV. Dotazníkem byly získány údaje o sociální třídě, kuřáckém návyku, konzumaci alkoholu a byl měřen index tělesné hmotnosti. Aktivity antioxidačních enzymů a indexy zánětlivého stavu byly odhadovány standardními technikami. Významné asociace byly pozorovány pro: věk s α-1-antichymotrypsinem (p<0,0001) a s ceruloplasminem, proteinem i oxidázou (p<0,0001); kuřácký návyk s α-1-antichymotrypsinem (p<0,0001), s ceruloplasminem, proteinem i oxidázou (p<0,0001) a s glutathionperoxidózou (GPX) (p<0,0001).0001); sociální třída s α-1-antichymotrypsinem (p<0,0001), s kaeruloplasminem, jak proteinem (p<0,001), tak oxidázou (p<0,01) a s GPX (p<0,0001); index tělesné hmotnosti s α-1-antichymotrypsinem (p<0,0001) a s kaeruloplasminem, jak proteinem (p<0,001). Mezi konzumací alkoholu a žádným z měřených krevních enzymů nebyla zjištěna významná souvislost. Faktorová analýza vytvořila třífaktorový model (vysvětlující 65,9 % variability souboru dat), který zřejmě naznačuje úzké vzájemné vztahy mezi antioxidanty.

Úvod

Ischemická choroba srdeční je stále hlavní příčinou úmrtí v Evropě a USA.1 V posledních letech je velký zájem o patologickou roli volných radikálů při rozvoji aterosklerózy.2-5 Tělo vyvinulo komplexní obrannou strategii, aby minimalizovalo škodlivé účinky různých oxidantů. Ústředním prvkem této obrany jsou antioxidační enzymy v krvi. Patří mezi ně superoxiddismutáza (SOD, EC 1.15.1.1), glutathionperoxidáza (GPX, EC 1.11.1.9), kataláza (EC 1.11.1.6) a ceruloplasmin, které působí ve vzájemné souhře a chrání organismus před oxidačním poškozením.6 Erytrocytární superoxiddismutáza je závislá na mědi (i když zinek má strukturální úlohu) a urychluje dismutaci superoxidu O2- na H2O2 a O2.7 Enzym glutathionperoxidasa obsahující selen detoxikuje H2O2 tím, že využívá redukovaný glutathion (GSH) a H2O2 jako substráty za vzniku H2O a oxidovaného glutathionu (GSSG);8 GSSG je zase redukován na GSH enzymem glutathionreduktasou, která vyžaduje jako reduktant NADPH; ten je dodáván prostřednictvím enzymu glukosa-6-fosfátdehydrogenasy (G-6-PDH, EC 1.1.1.49). Kataláza je velký enzym obsahující na svých aktivních místech železo vázané na hem. Odstraňuje H2O2 jeho přímým rozkladem na O2.9 V plazmě působí ceruloplasmin (oxidáza) jako důležitý antioxidant při ochraně organismu před oxidačním stresem. Tento posledně jmenovaný enzym je spolu s alfa-1-antichymotrypsinem také reaktantem akutní fáze a může být použit k indikaci zánětlivého stavu.

Shromažďující se důkazy naznačují, že změny nebo poruchy těchto obranných enzymových systémů mohou přispívat k rozvoji aterosklerózy nebo ji zhoršovat.10-12 Jiné studie zkoumající vliv stárnutí na aktivitu antioxidačních enzymů myokardu a peroxidaci lipidů u potkanů ukázaly, že antioxidační kapacita myokardu je během stárnutí oslabena, což zvyšuje možnost oxidačního poškození.13 U lidí bylo prokázáno, že kouření, které je hlavním rizikovým faktorem aterosklerózy, snižuje aktivitu plazmatické glutathionperoxidázy.14 Autoři studie tvrdí, že toto zjištění je v souladu s názorem, že kuřáci jsou vystaveni trvalé oxidační zátěži a že nedostatečný antioxidační stav v kombinaci se zvýšenou zátěží volnými radikály způsobenou kouřením může zhoršovat oxidaci LDL a zvyšovat jeho aterogenní vlastnosti. To může platit zejména u populace s vysokým rizikem ischemické choroby srdeční. Snížená aktivita glutathionperoxidázy, superoxiddismutázy a katalázy byla pozorována také u krevních destiček jedinců s ischemickou chorobou srdeční15 a u jedinců s akutním infarktem myokardu.16-17

Většina studií zabývajících se aktivitou antioxidačních enzymů a srdečními chorobami byla provedena u vysoce vybraných osob a na relativně malých vzorcích. Prospektivní kohortová studie Caerphilly týkající se ischemické choroby srdeční, cévní mozkové příhody a poklesu kognitivních funkcí poskytla příležitost studovat aktivity antioxidačních enzymů v krvi u reprezentativního vzorku mužské populace a zkoumat možné vzájemné vztahy mezi aktivitami antioxidačních enzymů, věkem, sociální třídou, kuřáckým návykem a konzumací alkoholu.

Metody

Úplný popis kohorty Caerphilly a sběru údajů týkajících se srdečních chorob, cévní mozkové příhody a dalších onemocnění byl uveden jinde;18-21 zde je uveden pouze stručný popis. Ve fázi I (1979-1983) bylo původně vyšetřeno 2512 mužů ve věku 45-59 let. Muži byli následně sledováni vždy po pěti letech (ve fázích II a III) a nedávno byli pozorováni ve fázi IV. Když bylo mužům 55-69 let (fáze III), byly jim odebrány vzorky krve nalačno pro stanovení antioxidačních vitaminů a enzymů v krvi. Bohužel vyšetření mužů byla zahájena několik měsíců předtím, než se naskytla příležitost pro tyto odhady, a krev pro odhady antioxidantů nebyla získána od několika set mužů. Plazma byla oddělena od erytrocytů nízkorychlostní centrifugací a erytrocyty byly promyty fyziologickým roztokem. Plazma i promyté erytrocyty byly před analýzou skladovány při teplotě -70 °C.

Antioxidační enzymy byly odhadnuty standardními metodami následovně. Aktivity superoxiddismutázy, glutathionperoxidázy a glukózo-6-fosfátdehydrogenázy byly odhadnuty na autoanalyzátoru Cobas Fara pomocí komerčně dostupných souprav dodávaných společností Randox Laboratories. Aktivita katalázy v erytrocytech byla odhadnuta metodou Aebi22 pomocí spektrometru Varian Cary 1. Erytrocytární hemoglobin (Hb) byl měřen modifikací metody popsané Dacie a Lewisem23 za použití speciálního hemoglobinometru (Coulter Electronics). Test byl kalibrován pomocí standardu kyanmethemoglobinu (HiCN), který odpovídá B.S. 3985 (BDH) podle doporučení výrobce. Proteiny akutní fáze alfa-1-antichymotrypsin a caeruloplasmin byly hodnoceny pomocí imunoturbidometrických metod a komerčních souprav dodávaných firmou Dako, s tou výjimkou, že alikvoty použité pro tyto analýzy byly před analýzou na autoanalyzátoru Cobas Fara ředěny ručně, nikoli automaticky. Aktivita ceruloplasmin oxidázy (CpO) byla odhadnuta na analyzátoru Cobas Fara s použitím p-fenylendiamin dihydrochloridu jako substrátu.24 Odchylky uvnitř šarže a mezi šaržemi byly <6,5 % pro všechny měřené analyty.

Další údaje, včetně kuřáckého návyku, sociální třídy, konzumace alkoholu a indexu tělesné hmotnosti, byly shromážděny pomocí dotazníku, resp. fyzikálního měření; veškeré podrobnosti byly popsány dříve.19

Statistická analýza

Rozložení různých měřených parametrů byla zkoumána na normalitu pomocí Kolmogorovova Smirnovova testu. Výsledky jsou prezentovány jako průměry, mediány a směrodatné odchylky (SD) spolu s průměry a 95% rozsahy získanými po případné transformaci dat. Vzájemné vztahy mezi různými soubory údajů byly zkoumány korelací, regresí v korelační matici a faktorovou analýzou a pro tyto účely byly proměnné transformovány, obvykle na logaritmy, aby se dosáhlo normality nebo téměř normality, pokud to bylo vhodné. Faktorové analýzy byly prováděny ve snaze extrahovat relativně malý počet faktorů nebo základních konstruktů, které by zjednodušily vzájemné vztahy proměnných a usnadnily tak pochopení složitých procesů.

Výsledky

V době vyšetření fáze III (1989-1993) bylo v kohortě 2154 mužů. Vzorky krve nalačno byly získány od 1800 z nich, což představuje 84 % celkové kohorty.

Prostředky, mediány a SD pro antioxidační enzymy studované v kohortě mužů z Caerphilly jsou uvedeny v tabulce 1. Pouze u SOD a GPX bylo zjištěno normální rozdělení. Výsledky jsou uvedeny pro všechny enzymy jako surové údaje a také po logaritmické transformaci. Vzájemné vztahy (uvedené jako korelační koeficienty) mezi různými antioxidačními enzymy v kohortě jsou uvedeny v tabulce 2. Významné korelace byly pozorovány mezi řadou ukazatelů, zejména mezi těmi, které jsou spojeny prostřednictvím zánětlivého stavu, tj. alfa-1-antichymotrypsin a caeruloplasmin (protein a oxidáza). Souvislosti hladin krevních enzymů byly také porovnávány s řadou proměnných, konkrétně: věkem, kuřáckým návykem, sociální třídou, indexem tělesné hmotnosti a konzumací alkoholu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3. Údaje byly zkoumány jednak jako nezpracované údaje, jednak byly standardizovány, aby se zohlednil možný vliv matoucích faktorů. Nebyly mezi nimi zjištěny žádné zásadní rozdíly. Proto jsou uvedeny pouze standardizované údaje. Významné asociace byly pozorovány pro: věk s alfa-1-antichymotrypsinem a s ceruloplasminem, a to jak s proteinem, tak s oxidázou; kuřácký návyk s alfa-1-antichymotrypsinem, s ceruloplasminem (protein a oxidáza) a s GPX; sociální třídu s alfa-1-antichymotrypsinem, s ceruloplasminem (protein a oxidáza) a s GPX; index tělesné hmotnosti s alfa-1-antichymotrypsinem a s ceruloplasminem protein. Mezi konzumací alkoholu a žádným z měřených krevních enzymů nebyla zjištěna významná souvislost.

Při použití faktorové analýzy na sedm plazmatických proměnných (n=1689) byly odvozeny dva společné faktory s vlastními hodnotami 2,24 a 1,40, které dohromady vysvětlily 52,1 % celkové variability souboru dat. Faktor 1 vysvětlil 32,0 % celkové variability souboru dat. Byl nejvíce spojen s alfa-1-antichymotrypsinem, proteinem caeruloplasminem a oxidázou (a v menší míře se SOD a katalázou). Faktor 2 vysvětlil dalších 20,1 % celkové variability. Nejtěsněji souvisel se SOD, katalázou, G-6-PDH a GPX.

Míry adekvátnosti modelu byly přiměřené, s významnou výjimkou nízkých komunalit tří proměnných (0,42 pro SOD, 0,34 pro G-6-PDH, 0,18 pro GPX), které činily model nepřijatelným.

Třífaktorový model byl rovněž zkonstruován. Přestože třetí faktor vysvětluje nepatrně méně z celkové variability souboru dat, než by vysvětlila jednotlivá proměnná, komunalita proměnných (a další míry adekvátnosti modelu) se zlepšují, což naznačuje, že tento model poskytuje vhodnější popis vzájemných vztahů mezi sledovanými proměnnými. Faktor 3 vysvětluje dalších 13,8 % celkové variability souboru dat, což dává pro třífaktorový model celkem 65,9 %. Faktor 1 je stále nejtěsněji spojen s alfa-1-antichymotrypsinem, ceruloplasminovým proteinem a oxidázou. Faktor 2 je nejvíce spojen se SOD a katalázou (a v mnohem menší míře s G-6-PDH). Faktor 3 je nejtěsněji spojen s GPX a G-6-PDH.

Nejvýraznějším zlepšením adekvátnosti třífaktorového modelu oproti dvoufaktorovému modelu je zlepšení pospolitosti GPX (z 0,18 na 0,78). Zlepšily se také komunality SOD a G-6-PDH (na 0,63 a 0,42). Zdá se, že GPX má zvláštní úlohu, která není obsažena v třífaktorovém modelu.

Diskuse

Kohorta mužů z Caerphilly byla od počátku projektu v roce 1979 rozsáhle studována.25-29 Jednou ze silných stránek současných údajů je, že byly získány z reprezentativního vzorku populace. Caerphilly v jižním Walesu je typickou průmyslovou/obytnou oblastí, i když rozložení sociálních tříd naznačuje, že může existovat určitá tendence k manuálním profesím. Cílem této studie bylo získat popisnou statistiku a prozkoumat možné vzájemné vztahy mezi aktivitami antioxidačních enzymů v krvi za použití faktorové analýzy jako techniky redukce dat a tvorby hypotéz. Kromě toho byly zkoumány možné vztahy mezi antioxidačními enzymy a řadou proměnných životního stylu. Přestože v současné době neexistují definitivní referenční rozmezí pro antioxidační enzymy SOD, GPX a katalázu, byly výsledky nejprve porovnány s dříve publikovanými údaji a teprve poté byly zkoumány možné vztahy mezi antioxidačními enzymy a faktory životního stylu.

Aktivita SOD se ve vzorku kvantifikuje nepřímo, a to podle schopnosti tohoto vzorku redukovat zjištěný tok volných radikálů. Aktivity SOD se mezi jednotlivými analytickými systémy liší, a proto výrobci souprav nedoporučují referenční rozsahy. Údaje získané u vzorku z Caerphilly jsou však srovnatelné s dříve publikovanými výsledky při použití stejné analytické soupravy.30 Aktivity GPX se mohou lišit i v rámci jednotlivých analytických systémů a mezi nimi. Předpokládá se, že oxidovaný GPX je náchylný k deaktivaci kyanidem, který je obsažen v Drabkinsově činidle používaném ke stabilizaci hemoglobinu ve vzorcích a zabraňuje dalším enzymovým reakcím.31 Tento problém byl odstraněn přidáním dithiothreitolu/dithionitu do ředicího pufru. Výsledky z kohorty Caerphilly (38,0±11,0SD IU/g Hb) jsou podobné nedávno publikované studii (36,1±6,5 IU/g Hb).32 Tato studie však byla založena na velmi malém počtu (n=10) pacientů s infarktem myokardu. Průměrné aktivity katalázy v kohortě z Caerphilly byly srovnatelné s předchozí, i když mnohem menší studií30 z naší laboratoře na skupině 50-54letých mužů (52,9±17,1 srov. 49,0±20 K/g Hb, resp. n=18), kteří zase měli vyšší aktivity katalázy než v mnohem dřívější studii (z31.3±9,6 K/g Hb).33 Výrobce použité soupravy G-6-PDH uvádí „normální“ hodnotu 1,31±0,13 (průměr±SD) U/g Hb, která je srovnatelná s výsledky získanými v této studii (1,32±0,7 U/g Hb).

Bílkoviny akutní fáze jsou markery onemocnění. Ty, které byly naměřeny v této studii, jsou známé jako pozitivní proteiny akutní fáze (tj. zvyšují se při chorobných stavech). Obě průměrné hladiny alfa-1-antichymotrypsinu a caeruloplasminu (proteinu) spadaly do dříve stanovených referenčních rozmezí34 0,3-0,6, resp. 0,15-0,6 g/l. Bylo rovněž zjištěno, že jsou srovnatelné s hodnotami v kohortě britské části studie EPIC35 , zatímco aktivity kaeruloplazminoxidázy byly podobné jako v šetření z roku 1994.36 Tabulka 3 ukazuje, že celkově se antioxidační enzymy v krvi s věkem měnily jen málo. Jak se očekávalo, proteiny akutní fáze (měřítko zánětlivého stavu) byly pozitivně spojeny s věkem. Oba proteiny akutní fáze vykazovaly významné pozitivní asociace s kuřáckým návykem. Pouze GPX vykazoval významnou asociaci (negativní) s kuřáckým návykem. Již dříve se ukázalo, že aktivita GPX v erytrocytech je u kuřáků nižší než u nekuřáků,37 což pravděpodobně odráží zvýšený oxidační stres, který se u této skupiny předpokládá v důsledku volných radikálů přítomných v kouři.38 Výsledky pro sociální třídu ukázaly trend ke zvyšování zánětlivého stavu (posuzováno podle zvyšujících se hladin proteinů akutní fáze) s klesající sociální třídou. Jediným enzymem, který vykazoval významnou souvislost se sociální třídou, byl enzym GPX, jehož aktivita byla snížena ve skupině manuálně pracujících. BMI vykazoval podobný vzorec jako ostatní zkoumané faktory životního stylu, asociace však nebyly tak silné. Trendy a asociace pozorované u nižších sociálních tříd nebyly neočekávané, okolnosti prostředí a faktory životního stylu, jako je kouření, strava atd. pravděpodobně přispívají k vyšší úrovni zánětu a zvýšenému BMI.

Faktorová analýza dat poskytla třífaktorový model, který vysvětlil 65,9 % variability souboru dat. Faktorová analýza odhalila řadu zajímavých aspektů. Faktor 1 modelu shromažďuje tři opatření, která jsou spojena prostřednictvím zánětlivých mechanismů. Faktor 2 zahrnuje dva „hlavní“ antioxidanty, a to SOD a katalázu. Pozorování, že faktor 3 je nejtěsněji spojen s GPX a G-6-PDH, je to, co by teorie předpovídala, protože druhý jmenovaný enzym produkuje redukované kofaktory pro redukci glutathionu, které zase mohou být využity prvním enzymem. Důkazy naznačují, že glukóza-6-fosfát je ústřední molekulou v buněčném metabolismu glukózy, která rozhodujícím způsobem ovlivňuje aktivitu pentózového fosfátového cyklu a prostřednictvím tvorby NADPH reguluje aktivitu GPX pro detoxikaci radikálů a také syntézu cholesterolu a triglyceridů.39

Enzym Cu Zn SOD přeměňuje O2– na H2O2. Erytrocytární GPX může vysokou rychlostí odstraňovat H2O2 a oxiduje GSH na GSSG. GSSG může být redukován na GSH pomocí NADPH produkovaného z G-6-PD. Kataláza má větší schopnost než GPX ničit H2O2 (produkovaný mimo jiné respiračním vzplanutím neutrofilů) tím, že jej rozkládá přímo na H2O; z hlediska molekul H2O2 zničených za min na molekulu enzymu je jedním z nejaktivnějších známých enzymů. Jeho afinita k H2O2 je však také nízká a pro vysokou aktivitu vyžaduje vysoké koncentrace H2O2, při nízkých koncentracích se s H2O2 vypořádává jen pomalu.

Molekula H2O2 má schopnost snadno procházet buněčnými membránami, a pokud vzniká extracelulárně, může difundovat do nejbližší buňky (včetně erytrocytů), kde je metabolizována antioxidačními enzymy. Proto by erytrocyty a další typy buněk mohly fungovat jako „zásobníky“ H2O2. Toto propojení antioxidačních obranných mechanismů v kombinaci s ukazateli zánětu (nebo oxidačního stresu) může být to, co je znázorněno v třífaktorovém modelu. To podporuje koncept vyváženého, spolupracujícího antioxidačního obranného systému v krvi, který závisí spíše na optimálních hladinách řady antioxidačních systémů než na koncentraci nebo aktivitě jediného antioxidantu, ale nevylučuje ani nesnižuje význam konkrétních antioxidantů v konkrétních situacích nebo podmínkách.

Závěrem lze říci, že hlavními zjištěními této studie je, že kaeruloplazmin (celkový a oxidázový) je zvýšen u kuřáků pouze v nižších sociálních třídách. Změny kaeruloplazminu se odrazily ve změnách reaktantu akutní fáze alfa-1-antichymotrypsinu a pravděpodobně souvisely se zánětem nebo stavem onemocnění. GPX byl jediným antioxidačním enzymem, který se významně měnil s životním stylem, zvyšoval se s věkem, ale byl nižší u kuřáků a osob z nižších socioekonomických tříd a s nižším BMI. Souhrnně tyto výsledky naznačují sníženou antioxidační ochranu souběžně s oxidačním/zánětlivým stresem. Výsledkem faktorové analýzy byl třífaktorový model vysvětlující 65,9 % variability souboru dat, což zřejmě naznačuje úzké vzájemné vztahy mezi antioxidačními enzymy.