Asymetrická syntéza batrachotoxinu: Enantiomerní toxiny vykazují funkční divergenci vůči NaV

Fenotypové účinky akutních jedů, které se vyskytují mezi bohatou farmakopejí suchozemských a mořských živočichů, jsou zdokumentovány již od starověku. Izolace a charakterizace toxických sloučenin zpřístupnila důležitá chemická činidla pro studium složitých biochemických okruhů (1). Studie tohoto typu odhalily velké množství peptidových a nízkomolekulárních látek, které cílí na napěťově řízené sodíkové iontové kanály (NaVs), obligátní třídu membránových proteinů pro bioelektrickou signalizaci (1-4). Do souboru známých modulátorů NaV patří tři strukturně příbuzné látky, (-)-batrachotoxin , veratridin a akonitin (obr. 1A) – stericky velké lipofilní deriváty aminů, o nichž se předpokládá, že mají společné vazebné místo v oblasti vnitřních pórů NaV (3) (místo 2, obr. 1B). Vliv těchto toxinů na iontové hradlo se však výrazně liší. Na jedné straně je (-)-BTX, primární toxická složka kolumbijských jedovatých žab (rod Phyllobates), plným agonistou NaV, který způsobuje snadnější otevírání kanálu při hyperpolarizovaných membránových potenciálech a blokuje rychlou inaktivaci (kromě jiných charakteristických účinků) (3-5). Naopak působení veratridinu a akonitinu lze nejlépe popsat jako částečný agonismus, respektive inhibici funkce kanálu (5). Navzdory nedávným poznatkům strukturní biologie o trojrozměrné architektuře prokaryotických NaV (6-9) chybí molekulární pochopení vlivu toxinů v místě 2 na vedení iontů a kinetiku iontového hradla. Studie struktury a aktivity toxinů v kombinaci s experimenty s mutagenezí proteinů mohou odpovědět na otázky týkající se dynamické povahy funkce kanálů a mohou být vodítkem pro racionální návrh nízkomolekulárních modulátorů aktivity NaV (1). Účinnost (-)-BTX (10), jeho historie jako archetypální malomolekulární sondy místa 2 (4) a jeho bezkonkurenční účinky na bránění kanálu z něj činí optimální „hlavní“ sloučeninu pro takový výzkum.

(-)-Vazba BTX na NaVs mění všechny aspekty funkce kanálu, což vede k hyperpolarizovanému posunu napěťové závislosti aktivace, inhibici rychlé i pomalé inaktivace, snížení jednokanálové vodivosti a snížení iontové selektivity (3, 4). Využitelnost tohoto přírodního produktu jako aktivátoru NaV vedla ke značnému vyčerpání světových zásob, které kdysi přesahovaly 1 g, ale v roce 2009 činily méně než 170 mg (11, 12). Od roku 1963, kdy byl toxin poprvé izolován Märkim a Witkopem z jedovatých žab sbíraných v severním deštném pralese Kolumbie (13), byl Phyllobates zařazen na seznam ohrožených druhů, a proto je sběr přírodního (-)-BTX z tohoto zdroje omezen. (-)-BTX byl také identifikován u vybraných druhů ptáků (rody Pitohui a Ifrita) (14) a brouků (rod Choresine) (15), ale pouze v malých množstvích (např. ~1,8 μg (-)-BTX na brouka). Ačkoli byly zveřejněny polosyntézy (16) a racemické syntézy (17) BTX-A (obr. 1C), sloučeniny postrádající pyrrolový ester C-20, délka každé z těchto prací (>45 lineárních kroků) vylučuje snadnou výrobu (-)-BTX nebo vybraných analogů. Proto naše přání využít BTX a jeho modifikované formy pro zkoumání dynamiky kanálů a mechanismů iontového hradla motivovalo naše úsilí získat přírodní produkt pomocí de novo syntézy.

Retrosyntetická analýza (-)-BTX nás vedla k nastínění plánu, který by umožnil pozdní sestavení homomorfolinového kruhu E a vypracování allylového esteru C-20 (obr. 1C), což by usnadnilo přístup k modifikovaným formám toxinu. Předchozí studie vztahu struktury a aktivity s použitím malého počtu semisyntetických derivátů BTX (10, 18) a analogů BTX s C/D/E kruhem (19) odhalily význam esteru C-20, terciárního aminu a tetracyklického skeletu pro agonistickou aktivitu NaV. Rozluštění BTX-A odhaluje steroidní kostru 1, jejíž sestavení je ztíženo dvěma úhlovými skupinami na C/D-kruhové spojce, exomethylenem C-11 a alkenem C-8/C-9. Na základě těchto dvou skupin se podařilo zjistit, že BTX-A se nachází v oblasti C/D-kruhové spojky. Abychom maximalizovali konvergenci v našem syntetickém plánu, vymysleli jsme strategii odpojení 1 přes C kruh. Tato myšlenka by omezila problém konstrukce 1 na dva fragmenty, jeden vyjadřující systém A/B-kruhu (3, 20) a druhý obsahující D-kruhový cyklopentan (4, 21). Úspěšné provedení tohoto schématu by mohlo vést k výrobě požadovaného toxinu prostřednictvím posloupnosti lineárních kroků v celkovém počtu nejvýše 20 až 25.

Naše syntéza (-)-BTX začala spojením methylencyklopentanonu 4 (21) (obr. S1A) a vinylbromidu 3, k němuž se dospělo z (S)-(+)-Hajos-Parrishova ketonu prostřednictvím modifikované posloupnosti kroků původně nastíněné Parsonsem a spolupracovníky (20) (obr. S1B). Spojení fragmentů 3 a 4 za účelem vytvoření spojeného A/B/D-tricyklu 5 představovalo první z řady problémů při vývoji procesu. Původní pokus o provedení této transformace zahrnoval výměnu Li-Br 3 za n-BuLi (Bu, butyl) a postupné přidání enonu 4. Ačkoli se za těchto podmínek podařilo získat 5, výtěžek produktu nikdy nepřesáhl 30 %. Deuterium quenchingové experimenty s D2O potvrdily naši hypotézu, že α-deprotonace 4 je kompetitivní vůči požadované cestě adice ketonu. Byly zkoušeny transmetalační reakce vinyl-lithného druhu se ZnCl2, ZnBr2, MgBr2-OEt2 (Et, ethyl), CeCl3, Yb(OTf)3 (Tf, trifluormetansulfonát), CeCl3-2LiCl a LaCl3-2LiCl, ale žádné z těchto opatření se neukázalo jako účinné (22, 23). Přídavek jednoho ekvivalentu bezvodého LiBr do reakčního prostředí 3 zlepšil účinnost spojení o >20 % (24). Po tomto návodu optimalizovaný protokol s použitím 2,1 ekvivalentu t-BuLi, který pravděpodobně generuje jeden ekvivalent LiBr in situ, reprodukovatelně poskytl 5 jako jediný diastereomer ve výtěžku 65 % ve vícegramovém měřítku. Snadná syntéza tohoto materiálu a jeho desilylované formy 6 umožnila následné úsilí o identifikaci podmínek pro tandemovou anulaci kruhu C a instalaci kvartérního centra C-13.

Vyhodnocení dostupných metod pro uzavírání kruhu 1,6-enynů nás vedlo k úvaze o radikálově iniciovaných procesech (25). Za takových podmínek by mohl být zachycen počínající radikál C-13 3°, který by vytvořil úhlovou aminomethylenovou jednotku (nebo vhodný substitut). Snaha nejprve prozkoumat tvorbu C-kruhu na 6 však odhalila možnou chybnost tohoto plánu. Použití n-Bu3SnH a triethylboranu (Et3B) k podpoře cyklizačního děje vedlo ke vzniku dvou isomerů, 7 a 8, v poměru 1:5 ve prospěch nežádoucího produktu (obr. 2A). Studie provedené Storkem a Beckwithem a spolupracovníky ukázaly, že koncentrace substrátu a reakční teplota mohou ovlivnit způsob cyklizace (tj. 5-exo-trig versus 6-endo-trig) v radikály zprostředkovaných enynových reakcích (26, 27). Při zvýšené teplotě (130 °C) a pětinásobném zředění 6 byl pozorován zvrat v selektivitě a vznikl mírný přebytek požadovaného tetracyklu (poměr 1,3:1 7 a 8; obr. 2A). Kombinovaný výtěžek produktu této transformace přesáhl 90 %, což navzdory skromným výsledkům selektivity vybízí k dalšímu zkoumání této chemie.

Opakované pokusy o zachycení meziproduktu C-13 radikálu pomocí derivátů oximů a hydrazonů generovaných z formaldehydu nepřinesly očekávaný aminomethylační produkt (28). Byli jsme nuceni zvážit alternativní řešení a zjistili jsme, že modifikovaná silyletherová skupina připojená ze sousedního alkoholu C-14 by byla vhodně umístěna k zachycení radikálu 3° (29). Na základě dostupných precedentů byl pro modifikaci C-14 alkoholu v 6 vybrán alkynylsilylchlorid, Me3SiC≡CSiEt2Cl (Me, methyl) (30, obr. 2A). Úprava výsledného silyletheru (9) s n-Bu3SnH a Et3B při 150 °C vedla k cyklizační kaskádě za vzniku pentacyklu 10 jako výhradního produktu (31). V mezích detekce protonové nukleární magnetické rezonance (1H NMR) nevznikl při tomto procesu žádný z odpovídajících izomerů pětičlenného C-kruhu. Naše předběžné snahy o pochopení úlohy substitučních skupin C-14 na selektivitu reakce naznačují, že silylová ochrana alkoholu (spolu se zvýšenou reakční teplotou) podporuje uzavření kruhu 6-endo-trig. Ačkoli jsou pro zhodnocení těchto údajů o strukturní selektivitě nutné další studie, naše enynová cyklizační kaskáda nabízí konvergentní přístup k syntéze substituovaných steroidních skeletů a měla by usnadnit přístup k široké škále takových sloučenin.

Důkladná kontrola radikálových cyklizačních produktů odvozených z 6 nebo 9 odhalila neočekávaný výsledek týkající se struktury výsledné organostannanové části (obr. 2, A a B). Karbostannylace alkynové skupiny by měla poskytnout vinyl-cínový produkt, jak bylo zaznamenáno u reakce 6. Neočekávaně, když byl reakčním podmínkám podroben 9, byl jediným produktem allylstannan 10, což potvrdila NMR i rentgenová krystalografie. Vznik allylstannanu 10 lze racionalizovat mechanismem zahrnujícím přenos 1,4-H-atomu meziproduktu vinylového radikálu (32) (obr. 2B), což je návrh podpořený experimentem se značením deuteriem (obr. S5). Přestože tento výsledek nebyl plánovaný, účinnost a selektivita cyklizační reakce nás přiměla k rozhodnutí tento materiál postoupit. Do budoucna by univerzálnost allylstannanové skupiny měla sloužit budoucím snahám o přípravu BTX modifikovaných kruhem C.

Dostupnost 10 v devíti krocích z Hajos-Parrishova ketonu umožnila výrobu značného množství materiálu pro dokončení cílové syntézy. Excize přemosťujícího silyletheru v 10 byla provedena s přebytkem n-Bu4NF, čímž byl odhalen diolový meziprodukt, který byl následně převeden na 11 pomocí oxidace alkoholu zprostředkované kyselinou 2-jodoxybenzoovou a chemoselektivního štěpení vinylsilanu (57 %; obr. 2B). Konverze aldehydu 11 na chloroacetamid 12 byla provedena podle třístupňového postupu v jedné baňce (16, 33). Účinné uzavření homomorfolinamidového kruhu pomocí NaOEt (92 %) (17) poskytlo z 12 univerzální meziprodukt pro modifikaci jednotek C- i D-kruhu. Toho druhého bylo možné dosáhnout pomocí enoltriflátu D-kruhu, připraveného pomocí KN(SiMe3)2 a PhNTf2.

Vedení C-11α alkoholu z C-kruhu allylstannanu 13 představovalo jeden z obtížnějších problémů v našem přístupu k BTX (obr. 2B). Ačkoli protodestannylace 13 za vzniku odpovídajícího C-11 exo-methylenecyklohexanu měla omezený úspěch (34), všechny následné pokusy o oxidaci této sloučeniny na keton 15 (tj. O3, OsO4 a RuO4) nevedly k získání produktu. Inspirováni zprávou Kima a Fuchse jsme se pokusili převést 13 na odpovídající allylchlorid pomocí CuCl2 (35). Naštěstí vedení této reakce v dioxanu za aerobních podmínek poskytlo enal 14 ve výtěžku 85 % s pouze malým množstvím chlorovaného produktu (~10 %). Ačkoli mechanistické detaily této přeměny zůstávají nejasné, je nám znám pouze jeden další zdokumentovaný příklad takové oxidační reakce, který využívá vanadiový katalyzátor a O2 (36). Enal 14 je vhodně připraven k přeměně na keton C-11 15 následováním řady kroků přeměny funkčních skupin, které jsou zvýrazněny Curtiovou přestavbou (37). Absence životaschopného chromoforu na batrachotoxininu A (BTX-A) ztěžuje čištění tohoto materiálu; proto byl v sekvenci vedoucí k 15 methoxyacetal C-3 vyměněn za p-methoxyfenethylalkohol.

Dokončení uhlíkového skeletu (-)-BTX bylo provedeno palladiem katalyzovanou křížovou vazbou tributyl(1-ethoxyvinyl)cínu na vinyltriflát 15 (obr. 3A) (38). In situ hydrolýza počátečního enolového éteru s 1 M kyselinou šťavelovou poskytla enon 16 (77 %). Po rozsáhlém výběru redukčních činidel bylo dosaženo úspěšné stereoselektivní globální redukce enonu 16 ve výtěžku 33 % působením čerstvě připraveného AlH3 (39). Předpokládáme, že Lewisův základní laktam (nebo jeho redukovaná forma) působí jako klíčový stereokontrolní prvek, protože ošetření enonu 15 alternativními hydridovými redukčními činidly poskytlo výhradně nežádoucí alkohol C-11β. Použití AlH3 také upřednostnilo generaci správného epimeru C-20 allylového alkoholu, což je sterochemický výsledek, který lze racionalizovat pomocí modelu odvolávajícího se na chelatační kontrolu (38). Deprotekce produktu z redukce AlH3 za kyselých podmínek poskytla (-)-BTX-A ve výtěžku 83 % (17). Nakonec byla za použití modifikace Tokuyamova, Dalyho a Witkopovy (-)-BTX-A acylačního protokolu se směsným anhydridem připraveným z ethylchloroformiátu a 2,4-dimethyl-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (10) dokončena syntéza 2 mg (-)-BTX (79 %, celkový výtěžek 0,25 %) ve 24 krocích z (S)-(+)-Hajos-Parishova ketonu. Produkt byl ve všech ohledech shodný se vzorkem přírodního materiálu a s dříve zaznamenanými spektroskopickými údaji (40, 41). Náš syntetický plán rovněž umožnil miligramovou přípravu nepřirozeného antipodu toxinu, (+)-BTX, známého benzoátového esteru (-)-BTX-A (BTX-B; obr. 3B) (42, 43) a enantiomeru této sloučeniny (ent-BTX-B).

Elektrofyziologická charakterizace syntetického (-)-BTX a BTX-B vůči krysímu NaV1.4 (rNaV1.4) potvrdila, že druhý jmenovaný funguje také jako agonista a je podobně silný jako přírodní produkt (obr. S6 a tab. S12). Předchozí zprávy a naše vlastní studie naznačují, že esterová skupina BTX-B je stabilnější než oxidačně citlivý acylpyrrol BTX; proto byly provedeny další experimenty s první sloučeninou (42, 43). Syntetický BTX-B byl testován proti podskupině reprezentativních izoforem NaV včetně rNaV1.4, lidského NaV1.5 a lidského NaV1.7. Aplikace 10 μM BTX-B na buňky vaječníků čínského křečka exprimující jeden podtyp NaV vedla ve všech případech k trvalému sodíkovému proudu (obr. 4A a obr. S7 a S8). Agonismus izoforem NaV závislý na použití BTX-B zabránil ustálené inaktivaci >80 % populace sodíkových kanálů (obr. 4A a obr. S8). BTX-B také vyvolal charakteristický hyperpolarizační posun (-44,9 až -51,5 mV) v polomaximálním napětí (V0,5) aktivace izoforem NaV divokého typu (obr. 4B a tab. S13). Podobnost těchto údajů je v souladu s vysokou zachovalostí proteinových sekvencí mezi podtypy NaV ve vnitřních šroubovicích S6 lemujících póry, které tvoří předpokládané vazebné místo pro toxin (obr. S9).

V návaznosti na dřívější práce naší laboratoře (19) a dalších (44, 45) jsme si položili otázku, zda se enantiomerní forma BTX bude s vysokou afinitou vázat na NaV s analogickými funkčními účinky. Takovou otázku lze zodpovědět pouze za předpokladu dostupnosti de novo syntézy toxinu. Proto byly provedeny elektrofyziologické záznamy s ent-BTX-B proti rNaV1.4. Tato data odhalila, že ent-BTX-B je antagonista kanálu závislý na použití a stavu, s naměřenou polomaximální inhibiční koncentrací 5,3 ± 0,6 μM . Koncentrace pro polomaximální inhibici NaV pomocí ent-BTX-B je podobně velká jako polomaximální účinná koncentrace pro agonismus BTX-B (1,0 ± 0,1 μM; obr. S10) naměřená za identických podmínek. Pozoruhodné je, že na rozdíl od přirozeného antipodu způsobila vazba ent-BTX-B pouze minimální posun V0,5 aktivace a V0,5 ustáleného stavu inaktivace (tab. S14). Blokáda kanálu byla navíc tímto inhibitorem plně reverzibilní.

Pro zjištění, zda BTX-B a ent-BTX-B sdílejí překrývající se vazebné místo v oblasti vnitřního póru NaV, byl ent-BTX-B testován proti pěti jednobodovým mutantům rNaV1.4, u kterých bylo již dříve prokázáno, že destabilizují vazbu BTX (obr. 4, E a F, a obr. S12) (19). Mutace N434 (46), L1280 (47), F1579 (48) a N1584 (48) na lysin vedly k ~3- až 30násobnému snížení blokování proudu pomocí 5 μM ent-BTX-B. Proti F1236K (49) si však ent-BTX-B zachoval významnou aktivitu (33,6 ± 2,1 % inhibice proudu). Zjevný rozdíl mezi ent-BTX-B a BTX-B naznačuje překrývající se, ale neidentickou vazebnou oblast v dutině vnitřního póru. Zdá se, že otevřený kanál je dostatečně velký, aby pojal lipofilní terciární aminové ligandy (19, 45, 50). Jemné změny v pozici vazby těchto ligandů zřejmě dramaticky mění funkční odpověď proteinu. Budoucí výzkumy budou zaměřeny na vymezení přesných interakcí mezi kanálem a toxinem, které odlišují aktivaci od inhibice deriváty BTX a příbuznými lipofilními toxiny.