II Mikrobiologické specifikace jakosti
Gnotobiotická zvířata, ať už axenická (tj., bez zárodků) nebo spojená s definovaným mikrobiomem sestávajícím z několika nepatogenních bakterií, tvoří malou část zvířat používaných ve výzkumu; jejich používání však pravděpodobně poroste s nárůstem výzkumu hlubokých vlivů a rozmanitých účinků mikrobiomu na lidské zdraví a experimentálních reakcí výzkumných modelů (Bech-Nielsen et al., 2012; Friswell et al., 2010; Grada a Weinbrecht, 2013). Jak již bylo zmíněno, většina laboratorních zvířat je označována jako SPF, což znamená, že u nich HM prokázal, že jsou prostá patogenů uvedených na seznamu vyloučených zvířat.
Seznamy vyloučených zvířat pro hlodavce, králíky a další běžné druhy laboratorních zvířat byly v celém vyspělém světě značně harmonizovány díky úsilí organizací zabývajících se vědou o laboratorních zvířatech (Guillen, 2012; Nicklas, 2008; Nicklas et al., 2002) a globalizaci biomedicínského výzkumu. Konkurence o zákazníky navíc podněcuje prodejce k tomu, aby nabízeli SPF zvířata prostá nově objevených patogenů, a diagnostické laboratoře k vývoji testů na tyto patogeny (Shek, 2000). Seznamy vyloučení pro SPF myši a potkany jsou z řady důvodů rozsáhlejší než seznamy pro králíky a jiné běžné druhy laboratorních zvířat. Zaprvé, protože myši a potkani představují naprostou většinu zvířat používaných ve výzkumu, je logické, že o jejich původních patogenech je známo více než o patogenech jiných méně používaných druhů laboratorních zvířat. Rozmanitost inbredních a přirozeně i geneticky upravených imunodeficitních mutantních kmenů hlodavců vysoce náchylných k infekčním onemocněním (Compton et al., 2003; Franklin, 2006) ve spojení s citlivými imunoanalytickými metodami (Smith, 1986b) a pokroky v molekulární genetice (Compton a Riley, 2001) přispěly k objevení a charakterizaci hlodavčích patogenů (Fox et al., 1994; Ward et al., 1994a), o nichž se zjistilo, že jsou příčinou všudypřítomných, nevýrazných infekcí kolonií laboratorních hlodavců (Hsu et al., 2006; Shames et al., 1995). Převaha výzkumných modelů myších hlodavců navíc poskytla diagnostickým laboratořím a prodejcům silné podněty k vývoji a nabídce specifických sérologických a PCR testů na virové a jiné rychlé mikrobiální patogeny – které nelze detekovat přímým mikroskopickým vyšetřením nebo kultivační izolací – brzy po jejich objevení. Naproti tomu komerční prodejci a diagnostické laboratoře měli jen malou poptávku ze strany výzkumných komunit a komunit zabývajících se laboratorní medicínou zvířat, aby poskytovali rutinní sérologické a PCR testy na králičí viry rozpoznané před desítkami let, jako je lapine parvovirus (Matsunaga a Matsuno, 1983) (jehož sekvenování nedávno ukázalo, že se jedná o bocavirus (osobní sdělení, K Henderson)), králičí enterický koronavirus (Deeb et al., 1993; Descoteaux a Lussier, 1990; Descoteaux a kol., 1985) a leporidní herpesvirus 2 (Matsunaga a Yamazaki, 1976). A konečně, rederivace pomocí hysterektomie nebo embryotransferu (ET) za účelem odstranění všech exogenních patogenů je standardním postupem pro SPF myší a potkanů, ale ne pro ostatní druhy.
Seznamy vyloučení SPF pro myši a potkany zahrnovaly všechny známé exogenní viry bez ohledu na virulenci, protože jako obligátní intracelulární parazité jsou viry inherentně invazivní; navíc bylo prokázáno, že i necytopatické virové infekce mění metabolismus hostitelských buněk (Oldstone et al..), 1982). Striktní dodržování dogmatu vyloučení všech exogenních virů z SPF myší a potkanů se však stalo nepraktickým v mnoha výzkumných institucích, kde jsou asymptomatické infekce MNV, především u geneticky modifikovaných myší, považovány za příliš rozšířené na to, aby mohly být eliminovány. Špičkové molekulárně genetické techniky nedávno odhalily myší astrovirus (Farkas et al., 2012), který je u myší pravděpodobně běžnější než MNV, a jistě najdou další rozšířené viry, které dosud unikaly detekci, protože jsou stejně jako MPV, MNV a myší astrovirus vysoce adaptované na hostitele a z velké části apatogenní i pro imunodeficitní hostitele. Jak bylo uvedeno, seznamy vyloučených virů u králíků a dalších druhů laboratorních zvířat jsou méně obsáhlé než u myších hlodavců.
Ektoparazité, helminti, patogenní prvoci, bakterie a houby jsou součástí seznamů vyloučených virů u všech druhů zvířat SPF. Patogenní bakterie a houby vyloučené pro SPF zvířata se od komenzálních a autochtonních (tj. původních) organismů liší především schopností překonávat anatomické a biochemické bariéry a usazovat se v nikách bez přítomnosti jiných mikroorganismů, jako jsou dolní dýchací a urogenitální cesty, vnitřní orgány a intracelulárně (Casadevall a Pirofski, 2000; Council, 2009; Merrell a Falkow, 2004). Patogenita nemusí být nutně neměnnou vlastností mikrobiálního druhu, protože běžně komenzální mikroby, jako je Escherichia coli, byly přeměněny na patogeny získáním genů virulence přenesených z jiných bakterií v mobilních genetických elementech, jako jsou plazmidy, fágy a transpozony (Dobrindt et al., 2004).
Mikrobi jsou klasifikováni jako primární patogeny, pokud mohou způsobit onemocnění u imunokompetentních hostitelů. Příkladem jsou salmonely, Mycoplasma pulmonis, Helicobacter hepaticus a Clostridium piliforme (etiologie Tyzzerovy choroby). Oportunní patogeny, jako jsou Pseudomonas aeruginosa, β-hemolytické streptokoky, Staphylococcus aureus a houby rodu Pneumocystis, způsobují onemocnění především u imunokompromitovaných hostitelů, ať už (1) imunosuprimovaných ozařováním nebo chemoterapií (Bosma et al., 1983; Cryz et al., 1983; Flynn, 1963; Homberger et al., 1993; Rosen a Berk, 1977; Waggie et al., 1988; Walzer et al., 1989; Weir et al., 1986; Weisbroth et al., 1999) nebo (2) vrozeně imunodeficitní, jako jsou athymické nahé a těžce kombinovaně imunodeficitní (SCID) myši (Bosma et al., 1983; Clifford et al., 1995; Dole et al., 2013b; Henderson et al., 2012; Pantelouris, 1968; Ward et al., 1996). Na seznamech vyloučených SPF pro imunokompetentní zvířata jsou většinou uvedeny pouze primární mikrobiální patogeny. Do seznamů pro imunodeficitní a geneticky modifikované mutantní linie jsou oportunní patogeny přidávány především komerčními prodejci. Protože není neobvyklé, že oportunisté, jako je S. aureus, způsobují onemocnění u standardních (tj. geneticky neupravených) imunokompetentních kmenů hlodavců (Besch-Williford a Franklin, 2007), které se často používají v programech rederivace a šlechtění geneticky upravených linií, zvýšila se poptávka po standardních, imunokompetentních kmenech hlodavců a zásobách prostých oportunistických i primárních patogenů. Tato podskupina zvířat SPF byla označena jako SOPF pro zvířata bez specifických oportunních patogenů.
Shrneme-li, infekční agens na seznamech pro vyloučení z SPF jsou určena obecnými kritérii a kritérii specifickými pro danou instituci. Obecně jsou seznamy pro vyloučení z SPF u myší a potkanů obsáhlejší než seznamy pro méně oblíbené druhy zvířat, protože bylo identifikováno a studováno více původních myších virových a hostiteli přizpůsobených mikrobiálních patogenů; sérologické a PCR testy pro myší patogeny jsou k dispozici brzy po jejich objevení; a rederivace za účelem odstranění všech exogenních patogenů z populací SPF myší a potkanů je standardní praxí. Seznamy pro vyloučení SPF všech druhů obvykle obsahují ektoparazity, endoparazity a mikroby klasifikované jako primární patogeny i viry; prodejci často přidávají oportunní patogeny pro imunodeficitní a geneticky modifikované mutantní myší modely.
Posouzení konsenzuálních standardů SPF může být v instituci problematické, pokud je prevalence infekcí vysoká nebo pokud jsou bariérové systémy a postupy nedostatečné, aby se zabránilo opakování a šíření náhodných infekcí. Mnoho akademických institucí, které se intenzivně věnují výzkumu, se rozhodlo, že přínosy eliminace prevalentních infekcí nedávno uznanými původci, jako jsou MNV a Helicobacter, které zřídka vyvolávají onemocnění a/nebo jsou v jejich výzkumných koloniích endemické již mnoho let, převáží narušení výzkumu a náklady s tím spojené. Eliminace (a vyloučení) převládajících patogenů a dodržování konsensuálních standardů SPF však snižuje riziko, že patogen infikuje další kolonie a naruší výzkum, a zjednodušuje výměnu zvířecích modelů a společné studie s jinými výzkumníky a institucemi.