Baktericidní aktivita extraktů zeleného čaje: význam nanočástic obsahujících katechin

Testování bioaktivity – antistreptokoková aktivita

Tři různé zelené čaje a jejich extrakty a částice získané při 5000 otáčkách za minutu a 10000 otáčkách za minutu a 20000 otáčkách za minutu byly zkoumány na jejich antibakteriální vlastnosti proti zubnímu patogenu S.mutans. Za účelem optimalizace koncentrace extraktu zeleného čaje pro další experimenty bylo testováno šest různých koncentrací (0 μl, 50 μl, 100 μl, 200 μl, 300 μl a 500 μl) GT-0 (bez odstranění částic) a 5K-S z GT 1, GT 2 a GT 3 proti S. mutans. Obrázek 2 ukazuje výsledky této studie. Jak je patrné z obr. 2(a), spektrofotometrická metoda ukázala, že v případě GT-0 a 5K-S s ohledem na všechny tři zelené čaje se antistreptokoková aktivita zvyšovala s rostoucí koncentrací. Bylo zjištěno, že koncentrace 300 μl vykazuje optimální antimikrobiální aktivitu, a proto byla rozlišena jako optimalizovaná koncentrace pro všechny další experimenty v této studii. Proto byly od této chvíle všechny experimenty prováděny s použitím 300 μl koncentrací proměnných zeleného čaje. Obrázek 2b) zobrazuje výsledky získané antimikrobiálním hodnocením pomocí metody celkového počtu životaschopných jedinců. Výsledky počtu destiček korelovaly s výsledky zjištěnými v případě měření zákalu na základě spektrofotometru. Dalším zajímavým pozorováním vyplývajícím z těchto výsledků je nepatrné zlepšení antimikrobiální aktivity pozorované při odstraňování částic při 5000 otáčkách za minutu (5K-S) ve srovnání s GT-0. Ve srovnání s GT 1-0 vykazovala GT 1-5K-S zvýšenou antibakteriální aktivitu, podobně v případě GT 2 a GT 3. Navíc bylo zjištěno, že GT 3 vykazuje nejvyšší antibakteriální aktivitu a GT 1 nejnižší antibakteriální aktivitu.

Protože odstranění částic ze zeleného čaje ukázalo změny v bioaktivitě extraktu zeleného čaje, bylo navrženo provést podrobné šetření týkající se studia tohoto účinku. Byl proveden systematický třístupňový proces odstřeďování při 5000 otáčkách za minutu, 10 000 otáčkách za minutu a 20 000 otáčkách za minutu určený k oddělení největších, menších a ještě menších částic z extraktu. Extrakt zbavený velkých částic (5K-S), malých částic (10K-S) a jemných částic (20K-S) a částic (5K-P, 10K-P a 20K-P) byl studován z hlediska jejich interakce se S. mutans a jejich jednotlivých antibakteriálních aktivit. Výsledky této studie jsou uvedeny na obrázku 3. Jak je patrné z obr. 3(a-1,a-2), metoda založená na zákalu i metoda počítání destiček potvrdily, že s ohledem na GT 1 mělo odstranění 5K-P za následek zvýšenou (okrajově zvýšenou) antibakteriální aktivitu extraktu (5K-S) ve srovnání s GT 1-0. Odstranění 10K-P nevedlo k žádnému dalšímu zvýšení a bylo zjištěno, že aktivita 10K-S je obvykle podobná aktivitě 5K-S. Odstranění 20K-P však vedlo ke zřetelné ztrátě antimikrobiální aktivity u 20K-S. Toto pozorování bylo zřejmé v případě GT 2 (obr. 3(b-1,b-2)) a GT 3 (obr. 3(c-1,c-2)). Tento trend měl sice různý stupeň kolísání od GT 1 přes GT 2 až po GT 3, ale skutečnost, že odstranění velkých částic zeleného čaje z extraktu nepatrně zvýšilo antibakteriální vlastnosti extraktu zeleného čaje a že vymýcení menších frakcí částic zeleného čaje z extraktu vedlo k výraznému snížení antibakteriální aktivity zeleného čaje, zůstává nezpochybnitelná.

Je však důležité zde zdůraznit, že ani částice 5K-P, 10K-P ani 20K-P nevykazovaly zvýšenou samostatnou antibakteriální aktivitu vyšší než extrakty. Částice 5K-P vykazovaly nulovou antibakteriální aktivitu, 10K-P vykazovaly omezenou míru antibakteriální aktivity, zatímco 20K-P vykazovaly určitou aktivitu uprostřed ostatních dvou protějšků.

Testování zubní bakterie v reálném čase

Aby bylo možné vyhodnotit tyto rozdíly v bioaktivitě extraktů zeleného čaje zbavených částic zeleného čaje v systémech reálného času, byly extrakty postaveny proti skutečným vzorkům zubního biofilmu od pěti různých lidských dobrovolníků. Byly testovány GT 0, 5K-S a 20K-S z GT 1, GT 2 a GT 3. Na základě těchto testů bylo zjištěno, že se jedná o nejčastěji se vyskytující bakterie. Na obrázku 4 jsou uvedeny celkové počty životaschopných bakterií podle metody počítání na destičkách, které ukazují, které bakterie přežily interakci se zeleným čajem. Bylo zajímavé pozorovat, že i přes složitost vzorku vykazoval 5K-S ve srovnání s GT 0 zvýšenou antibakteriální aktivitu, zatímco 20K-S vykazoval sníženou antibakteriální aktivitu s ohledem na všechny tři zelené čaje.

Fluorescenční zobrazení buněk pomocí akridinové oranžové, napomáhá vizualizaci a rozlišení mezi živými/mrtvými buňkami po ošetření. Zobrazovali jsme vzorky zubního biofilmu od pěti dobrovolníků před a po interakci s GT 0, 5K-S a 20K-S a kontrolou. Na obrázku 5 jsou zobrazeny výsledky fluorescence ukazující účinek proměnných zeleného čaje na dobrovolníka 1 (A), dobrovolníka 2 (B), dobrovolníka 3 (C), dobrovolníka 4 (D) a dobrovolníka 5 (E). Jak je patrné z obr. 5 (a), kontrolní snímky v A, B,C,D a E vykazují převážně oranžovou fluorescenci, což ukazuje na přítomnost aktivně metabolizujících živých zubních bakterií. Jak je patrné ze snímku, dislokovaný biofilm ze zubů si zachoval svou identitu biofilmu a v případě kontroly se jeví jako mikrobiální rohože. Ošetření GT 0 vedlo v případě všech dobrovolníků k očekávanému zabíjecímu účinku zeleného čaje (obr. 5b). Převažovaly zeleně fluoreskující oblasti (mrtvé buňky), mezi nimiž koexistovaly oblasti s oranžovou fluorescencí. Panel (c) zobrazuje výsledky ze supernatantu 5K-S GT 3, kde byly z extraktu odstraněny největší částice zeleného čaje. Jak je patrné z fluorescenčních mikroskopických snímků, nebyla pozorována žádná oranžová fluorescence a úplná zelená fluorescence svědčící o úplném zničení zubních bakterií/biofilmu. Zajímavé bylo také pozorování, že již nebyly pozorovány žádné biofilmové skvrny nebo rohože, biofilmové rohože byly rozpadlé a jediné, co je vidět, jsou rozptýlené shluky buněk ve všech testovaných vzorcích (A(c), B(c).C(c).D(c) a E(c). Konečně na obr. 5(d) jsou uvedeny výsledky interakce 20K-S, je patrný výrazný pokles zabíjecího účinku extraktu zeleného čaje. Výskyt oranžově fluoreskujících živých bakteriálních buněk naznačuje pokles antimikrobiální aktivity extraktu při odstranění nanosložek zeleného čaje. Přestože jsou pozorovány i zeleně fluoreskující mrtvé buňky, poměr živých/mrtvých buněk se zdál být změněn. Tyto výsledky potvrdily trend zaznamenaný pomocí spektrofotometrické metody a metody destičkového počítání antimikrobiální aktivity různých testovaných složek zeleného čaje.

PozorováníFE-SEM kontrolních a 5K-S interagujících dentálních bakterií je uvedeno na obr. 6 (a-c). Jak je patrné z obrázku, kontrola (obr. 6 (a)) vykazuje dobře vyvinutý biofilm (dobrovolník 4), zatímco interakce GT 0 (obr. 6 (b)) GT 3 a 5K-S (obr. 6 (c)) vedla k poškození buněk a biofilmu, jak naznačují zbytky buněk. Snímky pořízené pomocí CLSM (d) ukazují, že naprostá většina zubních bakterií od všech pěti dobrovolníků byla usmrcena pomocí GT 3 (5K-S). GT 3-GT 0 a 5K-S se ukázaly jako nejslibnější proti zubním bakteriím od všech dobrovolníků.

Charakterizace extraktu a částic

Vzhledem k tomu, že výsledky testování bioaktivity založené na antibakteriální aktivitě složek zeleného čaje ukazují, že přítomnost a nepřítomnost částic zeleného čaje skutečně mění aktivitu extraktu, je nutné, aby byly extrakty GT 0, 5K-S, 10K-S a 20K-S a poté částice 5K-P, 10K-P a 20K-P tří zelených čajů podrobně charakterizovány.

Biochemická charakterizace

Antibakteriální aktivita se obecně řídí celkovými fenolickými látkami, flavanoidy a antioxidační schopností extraktu. Všechny tyto parametry byly studovány a porovnávány mezi extrakty a částicemi použitými v této studii. Obrázek 7 a) ukazuje výsledky získané v případě GT 1, v případě flavanoidů, jak je patrné z grafu, nebyl pozorován velký rozdíl v obsahu flavanoidů mezi extrakty GT 0, 5K-S, 10K-S a 20K-S, GT 0 zřejmě vykazuje nepatrný nárůst ve srovnání s ostatními. V případě částic zeleného čaje však nejvyšší obsah flavanoidů zaznamenal 5K-P, přičemž 10K-P a 20K-P následovaly s podobným rozsahem flavanoidů, jaký byl zjištěn v extraktech. V případě GT 2 obr. 7b) a GT 3 obr. 7c) byl obsah flavanoidů odlišný, extrakty 5K-S a 10K-S vykazovaly nejvyšší obsah flavanoidů ve srovnání s GT 0. Částice 5K-P a 10K-P vykazovaly velmi nízký obsah flavanoidů. Výjimkou byly extrakty 20K-S, které vykazovaly nižší obsah flavanoidů ve srovnání s ostatními extrakty, a částice 20K-P, které vykazovaly vyšší obsah flavanoidů ve srovnání s ostatními částicemi.

Co se týče celkových fenolických látek, v GT 1 byla nejvyšší hodnota zjištěna u GT 0, zatímco ostatní vykazovaly nižší hodnoty. V případě GT 2 a GT 3 však byl opět pozorován podobný trend v případě obsahu fenolických látek, kdy všechny extrakty vykazovaly téměř podobný obsah fenolických látek. Extrakty 5K-P a 10K-P však vykazovaly nejmenší obsah fenolických látek ve srovnání s extraktem 20K-P.

Z hlediska antioxidační aktivity vykazovaly extrakty GT 1 (GT 0, 5K-S, 10K-S a 20K-S) velmi vysokou antioxidační aktivitu, zatímco 5K-P a 10K-P vykazovaly šestkrát nižší antioxidační aktivitu. Zde je však třeba zmínit, že 20K-P vykazovaly výrazně vyšší antioxidační aktivitu ve srovnání s 5K-P a 10K-P. U GT 2 a GT 3 byl tento trend výraznější, přičemž 5K-S a 10K-S vykazovaly vyšší antioxidační aktivitu ve srovnání s GT 0. Zřetelný pokles antioxidační aktivity byl však pozorován v případě 20K-S při odpovídajícím nárůstu aktivity u 20K-P z GT 2 a GT 3. Je třeba poznamenat, že mezi třemi studovanými zelenými čaji zaznamenal vyšší hodnoty těchto bioaktivních látek GT 3 těsně následovaný GT 2 a nakonec výrazně zaostalý byl GT 1. V případě GT 2 a GT 3 byl tento trend ještě výraznější. Tento trend silně koreluje s antimikrobiální bioaktivitou zelených čajů, která byla v pořadí GT 3 > GT 2 > GT 1.

Analýza FE-SEM

Částice 5K-P, 10K-P a 20K-P byly zobrazeny pomocí FE-SEM pro zjištění jejich morfologických detailů a velikosti. Na obrázku 8 jsou uvedeny morfologie částic 5K-P (a), 10K-P (b) a 20K-P (c) z GT 1 (A), GT 2(B) a GT 3 (C). Ve většině případů byly pozorovány nepravidelné morfologie bez zřetelného tvaru. Jak je patrné z obr. 8, částice 5K-P v případě GT 1 a GT 2 byly pozorovány jako částice makrorozměrné, ty vidíme viditelně v našem šálku zeleného čaje. Tabulka 1 zobrazuje jejich velikosti, částice 5K-P GT 2 (B) byly největší (50-80 μm), následované částicemi GT 1(B(a)), které byly v rozmezí velikostí 15-25 μm. Částice GT 3 5K-P byly relativně menší v rozmezí 6-30 μm (obr. 8(C(a))). Jak bylo pozorováno na mikrofotografiích, částice neměly pevnou velikost, což se u takto surových nestandardizovaných komerčních vzorků očekává. Částice 10K-P se v případě GT 1 pohybovaly v mikrorozměrech 4-10 μm (A(b)), u GT 2 to bylo 2-10 μm (obr. 8B(b)) a u GT 3 v rozmezí velikostí 0,5-3 μm (C(b)). Částice 20K-P byly menší mikro- až nano-rozměrné, přičemž částice GT 1 se nacházely v režimu 0,5-6 μm (A(c)), částice GT 2 (B(c)) byly 200 nm až 540 nm a částice GT 3 (C(c)) měly nejmenší velikost existující v režimu velikosti 50 nm-300 nm. Jak tedy vyplývá z těchto výsledků, částice 20K-P, které měly zvýšený obsah bioaktivních složek a vykazovaly antioxidační a antibakteriální vlastnosti, se vyskytovaly v režimu blízkém nano

UV-Vis spektrofotometrie

Obrázek 9 uvádí UV-Vis spektra extraktů a částic charakterizovaných na obsah EGCG. Atomssa & Gotlap 201539 uvedl absorbance pro skupinu katechinů: EGCG vykazuje absorbance v rozsahu 248-361 nm ve vodě s λmax při 273,6 nm; ECG 246- 363 nm λmax při 276,8 nm; spektrální rozsah EGC ve vodě je 254-378 nm a λmax při 269,6 nm a EC 252-328 nm s λmax při 278,4 nm. Jak je patrné z obr. 9a) GT-1, vidíme pouze absorpční pík EGCG při 273 nm. Z hlediska píku EGCG nebyl v rámci extraktů (GT 0, 5K-S, 10K-S a 20K-S) pozorován žádný rozdíl. V případě částic zeleného čaje však bylo pozorováno, že částice 20K-P vykazují výrazný nárůst intenzity EGCG ve srovnání s částicemi 5K-P a 10K-P. Bylo zajímavé pozorovat, že 20K-P obsahovaly téměř 50 % EGCG obsaženého v extraktech.

V případě GT 2 bylo zjištěno, že extrakty vykazují přítomnost dalších píků z rodiny katechinů v rozsahu 248-363 nm, jak je patrné z různých píků v tomto rozsahu na obr. 9b). Odstranění částic z extraktu vedlo k posunům píků. Výrazné posuny vykazovaly zejména extrakty. V případě částic 5K-P a 10K-P však bylo pozorováno, že vykazují výhradně píky EGCG, a to s nízkou intenzitou. Důraz je zde kladen na částice 20K-P, které vykazovaly téměř podobnou intenzitu katechinových píků ve srovnání s extrakty. Bylo pozorováno, že na rozdíl od částic 5K-P a 10K-P vykazovaly částice 20K-P nejen píky EGCG, ale také ostatní píky z rodiny katechinů, a to spíše podobně jako extrakty.

GT 3 (obr. 9c)), extrakty poskytovaly různé píky, včetně píků katechinů. Ve srovnání s GT 1 a GT 2 však samotné částice 5K-P a 10K-P vykazovaly vysokou intenzitu píků EGCG. Trend, že částice 5K-P a 10K-P vykazovaly pouze pík EGCG, se udržel i u GT 3. Částice 5K-P vykazovaly vyšší obsah EGCG ve srovnání se svými protějšky z GT 1 a GT 2, ale ve srovnání s částicemi 10K-P z GT 3 byl tento obsah mnohem nižší. Obsah EGCG v 10K-P GT 3 byl podobný jako v extraktech. 20K-P v tomto případě zaznamenaly nejvyšší katechinové píky a předčily i extrakty. Byly pozorovány podobné posuny píků, jaké byly zaznamenány v rámci extrakce vodou a extrakce rozpouštědlem v případě 20K-P Vs extraktů. Zajímavé bylo, že píky 20K-P byly užší a měly vysokou intenzitu. U 20K-P byl pozorován výjimečně vysoký pík při 269 nm odpovídající EGC. Prostřednictvím těchto studií bylo potvrzeno obecné zjištění, že 20K-P obsahují výrazně velké množství katechinů v GT-1, GT 2 a GT 3.

FT-IR

FT-IR spektrum získané z částic 5K-P, 10K-P a 20K-P GT 3, které vykazovaly maximální antibakteriální aktivitu a jedinečné vlastnosti, je uvedeno na obr. 10a). Spektra odpovídají charakteristickému pásu EGCG. Ponnuraj et al., 201540 uvádějí otisky EGCG při 3357,46 cm-1 pro skupinu O-H navázanou na aromatický kruh, 1691,27 cm-1 a 1616,06 cm-1 silné pro skupinu C = O, která spojuje trihydroxybenzoátovou skupinu a chromanovou skupinu, 1447,31 cm-1 pro skupinu C-H přítomnou v chromanovém kruhu, 1348.00 cm-1, 1222,65 cm-1 pro skupinu O-C = O, 1148,40 cm-1 pro skupinu O-H, 1041,37 cm-1 pro skupinu C-O-C, která spojuje chromanový kruh a trihydroxybenzoátový kruh, a 825,38 cm-1 pro skupinu C-H v aromatickém kruhu. Zajímavé a podpůrné bylo pozorování, že v závislosti na rostoucím odstřeďování byl pozorován zřetelný vzorec, který odpovídá klesající velikosti částic. Při 5K-P měly pásy EGCG nejnižší intenzitu, následované 10K-P a 20K-P vykazovaly pásy s vysokou intenzitou. To koreluje s výsledky pozorovanými také v UV studiích.

Obrázek 10(b) zobrazuje FT-IR spektra získaná z 5K-P a 20K-P z GT 1, V případě GT 1 nebyl mezi oběma částicemi velký rozdíl v pásmech EGCG. Tyto výsledky odpovídají výsledkům pozorovaným také v případě UVspektrofotometrických studií. Na obrázku 10c) jsou uvedena srovnávací spektra 20K-P z GT 1, GT 2 a GT 3. Je zřejmý gradientní vzorec nárůstu pásů EGCG v pořadí GT 1 < GT 2 < GT 3.

.