Buněčná linie Caco-2

Neorganické přístupy

Střevní epiteliální buněčné linie byly doposud hlavními in vitro modelovými systémy pro hodnocení střevních transportních procesů, zatímco enteroendokrinní buněčné linie jsou běžnými modely pro studium sekrece různých střevních hormonů. Zavedeným modelem pro enterocyty tenkého střeva je buněčná linie CaCo-2 (nebo subklon CaCo-2 TC7), odvozená z adenokarcinomu tlustého střeva. Tato buněčná linie se běžně pěstuje na transwellových destičkách až 3 nebo 4 týdny po ovlivnění pro studie střevního transportu živin, léčiv nebo jiných sloučenin pomocí radioaktivně nebo fluorescenčně značených substrátů (Farrell et al., 2013; Ganapathy et al., 1995; Wang a Li, 2017). Buňky HT-29 (a subklony) jsou buněčnou linií lidského karcinomu tlustého střeva dobře zavedenou pro výzkum střevních transportérů, zejména transportérů cukrů (Delezay et al., 1995; Liu et al., 2016). Pro studium úlohy transportérů ve střevní detekci živin jsou však zapotřebí jiné buněčné linie. Nejvýznamnějšími enteroendokrinními buněčnými liniemi používanými pro studie sekrece střevních hormonů jsou myší buněčná linie GLUTag (Emery et al., 2015), myší buněčná linie STC-1 (Jiang et al., 2016) a lidská buněčná linie NCI-H716 (Pais et al., 2014). Žádná z nich však neodráží komplexní biologii enteroendokrinních buněk in vivo (Kuhre et al., 2016). Enteroendokrinní buňky jsou rozmístěny po celém tenkém a tlustém střevě a jejich expresní vzorce různých střevních hormonů se velmi liší v závislosti na jejich umístění ve střevním traktu (Habib et al., 2012). Například počet buněk vylučujících GLP-1 (často označovaných jako L-buňky) se postupně zvyšuje od proximálního k distálnímu střevu, avšak počet buněk vylučujících GIP (označovaných jako K-buňky) se snižuje. Enteroendokrinní buněčné linie, které jsou všechny nádorového původu, tak představují velmi jednoduché a umělé modelové systémy pro zkoumání vnímání živin, sekrece střevních hormonů a základních molekulárních a regulačních mechanismů. Výhodou savčích buněčných linií je, že jsou dobře zavedeny mnoha laboratořemi po celém světě. K dispozici je mnoho vědeckých údajů i zavedených experimentálních protokolů. Navíc se s nimi snadno manipuluje a jejich kultivace je levná. Přesto jsou všechny tyto buněčné linie velmi jednoduché a umělé modelové systémy. Většinou pocházejí z nádorů a představují pouze jeden typ buněk, což neodráží složitost střevní sliznice, která se skládá z mnoha specializovaných typů buněk. Také jsou obvykle pěstovány ve dvou rozměrech, což neodráží trojrozměrnou architekturu nativního střeva.

Zejména pro studie vnímání živin a sekrece střevních hormonů je mnohem vhodnějším přístupem primární střevní buněčná kultura, která se v posledních letech prosadila jako spolehlivý model (Reimann et al., 2008). Primární kultury vypěstované z izolovaných střevních krypt mají tu výhodu, že je lze vytvořit z různých střevních segmentů (Parker et al., 2012) a z myší (divoký typ nebo knockoutovaná zvířata) (Diakogiannaki et al., 2013) nebo lidí (Habib et al., 2013). Zahrnují absorpční enterocyty a také různé podtypy enteroendokrinních buněk, které se nacházejí v nativním střevě. Tyto kultury však obsahují málo diferencované enterocyty, a proto nejsou vhodné pro detekci střevních transportérů a receptorů na proteinové nebo funkční úrovni. Jedná se o krátkodobý kultivační systém, který není vhodný pro dlouhodobé experimenty, a nelze jej pasážovat, což zvyšuje počet laboratorních zvířat potřebných pro přípravu kultury. Totéž platí pro izolované střevní epiteliální buňky (Grossmann et al., 1998), které zahrnují všechny typy slizničních buněk, ale vykazují velmi omezenou životaschopnost in vitro a nepředstavují intaktní epitel.

Krátkodobá stabilita je také omezením tkáňových explantátů, jako jsou například everted střevní kroužky (Roder et al..), 2014) nebo střevní váčky ze střeva myší nebo potkanů (Praslickova et al., 2012; Surampalli et al., 2016), které se často používají pro studie transportu. Everted střevní kroužky mohou být buď inkubovány se značenými substráty in vitro, nebo mohou být připraveny po perorálním podání např. radioaktivně značených transportních substrátů u hlodavců (Roder et al., 2014). Everted střevní kroužky lze použít i pro fluxové studie, protože luminální a bazolaterální kompartmenty lze zaměřit odděleně. Příprava a manipulace s nimi však není triviální a vyžaduje určité zkušenosti. Výhodou tkáňových explantátů je, že je lze připravit z různých střevních segmentů a jejich regionálně specifické vlastnosti in vivo jsou zachovány in vitro. Střevní explantát si zachovává svou přirozenou architekturu a sliznice je spojena s okolní tkání, jako je submukóza nebo svalovina, a jsou do ní zahrnuty neurony, lymfa, krevní cévy. V závislosti na vědecké otázce to může být výhoda nebo nevýhoda. Střevní snímání živin a následné vylučování střevních hormonů se někdy zkoumá v perfundovaném střevě hlodavců (Kuhre et al., 2015). Zvíře je anestetizováno a střevní lumen je perfundováno předpokládanými stimulanty ex vivo. Odebírá se bazolaterální tekutina a analyzuje se obsah střevních hormonů. Tato technika není technicky jednoduchá a etické překážky omezují široké využití této metody pro studie uvolňování střevních hormonů vyvolaných živinami.

Spolehlivým a dobře zavedeným modelem používaným pro studie funkčních vlastností a regulace střevních transportérů je heterologní exprese v oocytech Xenopus laevis (Hirsch et al., 1996). Po injekci mRNA je v oocytu exprimován protein, který je předmětem zájmu, a kinetiku transportu lze zkoumat pomocí radioaktivně značených substrátů nebo elektrofyziologických přístupů v případě elektrogenních transportérů (Schulze et al., 2014; Stelzl et al., 2016). Tato technika je vynikajícím nástrojem pro studium funkčních vlastností jednoho konkrétního transportéru, přestože se cílový protein nachází v umělém prostředí a nejsou přítomny žádné regulační faktory, jako by tomu bylo v savčí buňce. Kromě toho je při použití této techniky třeba vzít v úvahu dostupnost intaktních oocytů a komplikovanou manipulaci včetně injekce oocytů. Mnohem jednoduššími heterologními expresními systémy jsou kvasinky a E. coli. Umožňují generovat rekombinantní mutanty, které lze po vytvoření kultivovat nebo fermentovat ve větším měřítku a dodávat velké množství bílkovin. Přestože jsou tyto mikroorganismy levné a snadno se s nimi manipuluje, představují velmi zjednodušené modelové systémy pro zkoumání savčích proteinů, a zejména velkých membránových proteinů. Problémy, které se často vyskytují, jsou nesprávné skládání proteinu nebo neúspěšné vkládání do membrány. Proto jsou tyto systémy užitečné spíše pro strukturní charakterizaci purifikovaných proteinů nebo proteinových domén (Beale et al., 2015) než pro detailní studium funkce a regulace savčích transportérů.

Novými a slibnými přístupy, které byly zavedeny ve zcela nedávné minulosti, jsou trojrozměrné modely savčích buněčných kultur. Střevní buněčné linie, jako je CaCo-2 nebo HT-29, se pěstují na scaffoldech, čímž se vytváří architektura více podobná střevu, což vede k lepší diferenciaci (Chen et al., 2015). Jiné trojrozměrné modely jsou kultivovány přímo z lidských epiteliálních buněk tenkého střeva a myofibroblastů na potažených mikroporézních membránách (Maschmeyer et al., 2015a; Maschmeyer et al., 2015b) a nelze je množit in vitro. Tyto modely mají potenciál být vytvořeny pro studie transportu živin nebo léčiv a kultury vypěstované z lidských střevních epiteliálních buněk dokonce zahrnují různé typy slizničních buněk, nikoli však enteroendokrinní buňky. Totéž platí pro trojrozměrné bioprintované tkáně, což je další technologie, která vznikla velmi nedávno a získala si obrovskou pozornost. Tento přístup má větší význam pro regenerativní medicínu a transplantace než pro experimentální výzkum (Murphy a Atala, 2014). Bioprint různých tkání, včetně srdce, kůže a kostí, byl úspěšně zaveden, ale bioprint střevních tkání je zatím vzácný a je třeba jej dále zdokonalovat (Wengerter et al., 2016).

Napsat komentář