V naší studii, jsme retrospektivně zjišťovali přítomnost mutací CALR u kohorty 524 JAK2 V617F negativních pacientů, u nichž bylo klinické a/nebo laboratorní podezření na MPN, s hlavním cílem určit diagnostickou hodnotu této detekce. Ve sledovaném období nebyly mutace CALR u pacientů s podezřením na MPN v našem centru rutinně vyšetřovány, protože byly objeveny teprve nedávno1,2 . Naproti tomu mutace JAK2 V617F je již rutinně analyzována od svého objevení v roce 200520. Proto byli pacienti s mutací JAK2 V617F ze studie vyloučeni. Mutace MPL je u pacientů s MPN poměrně vzácným nálezem a většinou se vyskytuje u pacientů s ET nebo PMF21. V naší laboratoři bylo vyšetření MPL zařazeno do diagnostického algoritmu u pacientů s podezřením na MPN teprve nedávno a provádí se až po vyloučení mutací JAK2 V617F a CALR. Proto nebyl status MPL stanoven u všech našich pacientů v době prvního vyšetření.
Naše centrum je fakultní lékařská nemocnice sloužící oblasti s přibližně 1 000 000 obyvateli a je referenčním centrem pro hematologické malignity. Všichni pacienti odeslaní na hematologické oddělení byli nejprve vyšetřeni praktickými lékaři bez podrobnějších znalostí v oblasti hematologických malignit. Jak je uvedeno v tabulce 3, pouze část pacientů odeslaných na hematologické oddělení měla v době prvního vyšetření patologické klinické a/nebo laboratorní parametry podezřelé z MPN. Většina pacientů, kteří byli odesláni na hematologické oddělení, tedy byli jedinci bez hematologické malignity, neboť jsme zjistili, že 380 pacientů (380/524 = 72,5 %) bylo bez MPN. U těchto pacientů byly diagnostikovány sekundární změny v obsahu periferní krve způsobené různými stavy, jako je nedostatek železa, infekční a zánětlivá onemocnění, hyposplenismus, malignita, kouření, nedávná operace, užívání kortikosteroidů a chronická hypoxie. Proto byl počet CALR pozitivních pacientů v našem souboru nízký. Jako CALR pozitivní jsme identifikovali 4,4 % pacientů s podezřením na MPN, z nichž většina měla diagnózu ET nebo PMF. Většina podobných studií analyzovala počet CALR pozitivních pacientů s potvrzenou MPN; počet CALR pozitivních pacientů byl tedy mnohem vyšší a pohyboval se od 12 do více než 20 %22,23,24,25,26 . Na základě našich údajů by bylo přínosné zlepšit diagnostický přístup k pacientům se zvýšenou hladinou jedné nebo více krevních buněčných linií, protože ve většině případů to není způsobeno hematologickou malignitou. Pacienti by měli být rutinně vyšetřováni na nejčastější příčiny sekundární erytrocytózy, trombocytózy a leukocytózy a krevní obraz by měl být alespoň jednou zopakován při kontrolních návštěvách před odesláním na hematologické oddělení. Molekulárně genetické vyšetření by mělo být vyhrazeno pro pacienty s vysokým podezřením na klonální hematologické onemocnění a nemělo by být prováděno u všech pacientů odeslaných na hematologické oddělení.
Mutace CALR jsou běžně identifikovány u JAK2 V617F-negativních pacientů s ET1,2 . V našem centru byla při prvním vyšetření diagnostikována ET podle kritérií WHO z roku 2008 pouze u menšiny CALR pozitivních pacientů (7/23 = 30 %). Hlavním důvodem byla relativní rezervovanost vůči vyšetření kostní dřeně u pacientů s mírnou trombocytózou a nízkým rizikem trombotických komplikací. To však znamená, že jsme mohli podcenit počet pacientů s klonální trombocytózou. Potvrzením přítomnosti mutací CALR jsme mohli retrospektivně diagnostikovat 9 pacientů s ET podle modifikovaných kritérií WHO pro ET13. Přestože všichni tito pacienti byli sledováni na našem oddělení z důvodu vysokého podezření na klonální trombocytózu, má velký prognostický a terapeutický přínos možnost potvrdit diagnózu ET neinvazivním postupem, jako je molekulárně-genetické vyšetření. Mutace CALR jsou proto důležitým diagnostickým znakem ET, jak bylo nedávno potvrzeno i v literatuře27,28.
Všichni pacienti s PMF byli v době vyšetření na hematologickém oddělení diagnostikováni podle kritérií WHO. Identifikace mutace CALR retrospektivně potvrdila diagnózu, ale neměla žádný přímý diagnostický ani terapeutický dopad.
CMML je podtypem MDS/MPN a není striktně MPN12. Mutace CALR u pacientů s CMML jsou extrémně vzácné a nehrají důležitou roli v její patogenezi. Skupinová studie Zamory a kol. ukázala, že pouze u 1 ze 174 pacientů s CMML byla přítomna mutace CALR29. Pacient v naší studii, u kterého byla diagnostikována CMML prvního typu a později u něj došlo k progresi do myelofibrózy, mohl být při prvním vyšetření diagnostikován chybně, protože PMF a CMML mají mnoho společných znaků, včetně monocytózy a fibrózy kostní dřeně. V nedávné studii Hu et al. umožnila přesnější analýza překlasifikovat mnoho pacientů s diagnózou CMML na PMF, což ukazuje, že pro stanovení přesné diagnózy je třeba provést důkladnější analýzu, zejména u pacientů s molekulárními biomarkery typickými pro ET/PMF11,30.
Bylo popsáno více než 50 mutací CALR s posunem rámce a všechny se nacházejí v exonu 9 genu CALR. Existují dva hlavní typy mutací CALR: typ 1 (delece 52 bp; p.L367fs*46) a typ 2 (inzerce 5 bp TTGTC; p.K385fs*47). Ostatní mutace lze na základě jejich molekulárních charakteristik rozdělit na typ 1 podobný a typ 2 podobný31. V naší studii byl nejčastějším typem mutace CALR typ 1, což je v souladu s údaji z literatury2,16,32 . Mutace, které nejsou ani typu 1, ani typu 2, by měly být dále klasifikovány jako typ 1-like nebo typ 2-like, protože to může mít vliv na klinický fenotyp a v případě PMF dokonce na přežití17. Mutace podobné typu 1 a typu 2 byly v naší studii definovány pomocí algoritmu AGADIR15 , což je statistický aproximační algoritmus, který vypočítává sklon ke šroubovici pro 31 jedinečných sekvencí aminokyselin, které jsou mutacemi CALR změněny16. Tento algoritmus byl použit v podobných studiích a představuje důležitý nástroj při subklasifikaci mutací CALR16,17. Zdá se, že je nesmírně důležité správně definovat typ mutace CALR, protože to má také diagnostický dopad. Je známo, že patogenní jsou pouze mutace vedoucí k + 1 (-1 + 2) posunu čtecího rámce6. Ostatní mutace CALR mohou být zárodečné varianty CALR s neznámým klinickým významem. V naší studii byly u dvou pacientů zjištěny neframeshiftové mutace CALR. U jednoho z těchto pacientů byla v době vyšetření na hematologickém oddělení diagnostikována reaktivní trombocytóza a byl retrospektivně definován jako CALR pozitivní. Podrobná analýza potvrdila missense mutaci CALR, která vede k záměně kyseliny glutamové za kyselinu asparagovou na pozici aminokyseliny 398. Stejná mutace byla objevena u pacienta s chronickou neutrofilní leukémií (CNL) definovanou WHO ve studii Lasho et al. Jeho studie dospěla k závěru, že mutace CALR, které nevedou ke vzniku odlišného C-konce, naznačují jiný patogenetický mechanismus, který může být dosud neznámý33. V naší studii jsme předpokládali, že se u našeho pacienta nevyvinula mutace CALR, která by znamenala klonální hematologické onemocnění. Podle anamnézy, klinického vyšetření a laboratorních nálezů pacientky to nasvědčovalo především reaktivní trombocytóze. V době psaní tohoto článku byl pacient v dobrém zdravotním stavu bez jakýchkoli možných komplikací spojených s klonálním hematologickým onemocněním.
U dalšího pacienta s neframeshiftovou mutací CALR byla diagnostikována MPN-U. U tohoto pacienta byla zjištěna mutace CALR, která byla v době psaní tohoto článku v pořádku. Tento pacient nesl zárodečnou in-frame deleci v genu CALR (NM_004343.3 (CALR):c.1142_1144delAGG; p.(Glu381del)), která již byla rozpoznána u symptomatického pacienta s MPN34. Přestože motiv KDEL zůstal zachován, delece jedné aminokyseliny (p.(Glu381del)) vedla ke změně sekundární struktury proteinu i trojrozměrné struktury, což vedlo k závěru o patogenní povaze této in-frame delece23,34,35 . Náš pacient s MPN-U byl bohužel ztracen ze sledování a přesnou hematologickou diagnózu ani možné komplikace nebylo možné určit. Laboratorní nálezy však svědčily pro klonální hematologické onemocnění.
V naší studii jsme objevili čtyři nové mutace CALR v exonu 9, které, pokud je nám známo, dosud nebyly zaznamenány v databázi COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) ani HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk). Databáze COSMIC je největší světová odborně zpracovaná databáze somatických mutací u lidských nádorových onemocnění. Popisuje více než 4 miliony kódujících mutací36. Databáze HGMD představuje pokus o shromáždění všech známých (publikovaných) genových lézí zodpovědných za dědičné choroby člověka19. Nové mutace, které byly definovány v naší studii, jsou NM_004343.3 (CALR):c.1127_1145del19, p.(Arg376Glnfs*48), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsGTTGTC, p.(Lys385Serfs*47), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsTTTATC, p.(Lys385Ilefs*47) a NM_004343.3 (CALR):c.1132_1153del22, p.(Glu378Argfs*45). Všechny tyto mutace byly mutacemi podobnými typu 2.
ET a PMF jsou spojeny se zvýšeným rizikem trombotických a tromboembolických příhod, které představují významné příčiny morbidity a mortality37. Snížení rizika trombotických a tromboembolických komplikací je jedním z nejdůležitějších cílů léčby, zejména u pacientů s ET38. Tito pacienti jsou také vystaveni vyššímu riziku krvácivých komplikací, které mohou souviset s komplikacemi léčby nebo získaným von Willebrandovým syndromem (AVWS) v důsledku extrémní trombocytózy (trombocyty > 1000 × 109/l)28,39,40 . Riziko trombózy u pacientů s ET přesahuje 20 %41. Ve švédské studii se u 35 % pacientů s ET vyvinuly cévní komplikace42. U PMF jsou trombotické příhody přibližně stejně časté jako u ET43. Prevalence trombotických komplikací u pacientů s PMF se pohybuje od 7 do 30 %44,45,46. V naší studii byla prevalence trombotických komplikací u CALR pozitivních pacientů 30 %. U tří pacientů se však trombotická komplikace objevila více než 10 let před vyslovením podezření na diagnózu MPN. Skutečná prevalence trombotických komplikací v naší studii byla tedy nižší. U jednoho pacienta došlo ke krvácení do sklivce, které bylo důsledkem nedostatečné antikoagulační léčby warfarinem. Ani jeden ze dvou pacientů s krvácivou komplikací neměl v době komplikace extrémní trombocytózu. V porovnání s mutacemi JAK2 V617F a MPL je mutace CALR příznivá a je spojena s nižším výskytem trombotických příhod1,2,47 . U většiny pacientů s pozitivním výsledkem CALR, u nichž se vyvinuly trombohemoragické komplikace, byly diagnostikovány mutace typu 1 (71,4 %). Jak již bylo prokázáno, pacienti s mutacemi typu 1 měli vyšší riziko trombózy ve srovnání s pacienty s mutacemi typu 210.
Mutace CALR jsou v současné době známy jako jeden ze tří hlavních typů mutací, vedle JAK2 V617F a mutace MPL, u pacientů s ET nebo PMF. Stále však existuje 10-15 % pacientů s ET nebo PMF s neznámým molekulárně genetickým markerem, který je základem onemocnění. Tito pacienti jsou označováni jako „triple negativní „48. U těchto pacientů byly hledány nové molekulární biomarkery pomocí sekvenování kódujících exonů v myeloidních nádorových genech, což přineslo slibné výsledky. To může poskytnout personalizovaný přístup k diagnostice u pacientů s MPN49.
Mutace CALR u pacientů s MPN jsou rovněž zkoumány z hlediska jejich terapeutického potenciálu50,51,52. Mutace v exonu 9 CALR by mohly být cílem pro imunitní terapii nádorových onemocnění, protože bylo prokázáno, že působí jako imunogenní neoantigeny51. Při léčbě MPN by mohlo být výhodné kombinovat vakcíny CALR s imunomodulační léčbou53 , jako je interferon alfa (IFN-α)54 nebo ligand programované smrti 1 (PD-L1)55 , jako kombinovanou vakcinaci proti rakovině53. Mutace CALR, kromě toho, že jsou důležitými diagnostickými a prognostickými markery u pacientů s MPN, by se v budoucnu mohly stát důležitým terapeutickým cílem u podskupiny pacientů s MPN.
.