CD11c+ monocyty/makrofágy podporují chronický střevní zánět vyvolaný Helicobacter hepaticus prostřednictvím produkce IL-23

H. hepaticus vyvolaný zánět mění kompartment střevních mononukleárních fagocytů

Gram-negativní bakterie Helicobacter hepaticus (Hh) je neinvazivní organismus, který se běžně vyskytuje ve slizniční vrstvě myšího dolního střevního traktu. U divokých zvířat infikovaných touto bakterií nedochází k rozvoji střevní imunopatologie a slouží jako přenašeči infekce.21 Myši s genetickým deficitem v dráze IL-10/IL-10R jsou však citlivé na experimentální infekci Hh a dochází u nich k rozvoji těžkého zánětu tlustého střeva a slepého střeva (tyflokolitida) spojeného s hyperplazií epitelu.22 Myši s genetickým deficitem v dráze IL-10R jsou citlivé na experimentální infekci Hh, 23 Podobně infekce Hh u myší divokého typu se současným podáním monoklonálních protilátek proti IL-10R (mAbs) vyvolává střevní zánět závislý na IL-23 spolu s robustní odpovědí efektorových T-buněk typu 1/typu 17 (Th1/Th17).23 U myší infikovaných Hh a léčených protilátkami proti IL-10R, ale nikoli u neinfikovaných nebo samostatně léčených kontrol, se během 2-3 týdnů po infekci vyvinou histologické rysy kolitidy (obr. 1a). Hh a anti-IL-10R léčené myši dále vykazují výraznou infiltraci leukocytů v lamina propria (obrázek 1b), včetně převažujících populací neutrofilů a MHCII+ monocytů (obrázek 1c a doplňkový obrázek S1a online). V nezapáleném tlustém střevě dávají monocyty vstupující do lamina propria z krve přednost vzniku tkáňových makrofágů11 (definovaných jako CD11b+ CX3CR1hi Ly6Clo buňky, zelená podskupina), které exprimují vysoké hladiny CD64, MHCII, F4/80 a CD11c (obrázek 1d a doplňkový obrázek S1b). Tento proces se však během zánětu dramaticky mění a my jsme pozorovali výraznou akumulaci MHCII+ monocytů (definovaných jako CD11b+ CX3CR1int Ly6Chi buňky, červená podskupina) v lamina propria tlustého střeva. Tyto buňky se vyznačují expresí CD64 a MHCII a středními hladinami F4/80, CD24 a CD11c (obr. 1c-e a doplňkový obrázek S1a). V ustáleném stavu exprimují MHCII+ monocyty a makrofágy manózový receptor (CD206), což je marker spojený s protizánětlivou funkcí makrofágů.24 Exprese CD206 však byla u MHCII+ monocytů a makrofágů během kolitidy nižší (obr. 1f), což naznačuje, že během zánětu se mění nejen funkce monocytů, ale i makrofágů. Zjistili jsme totiž, že během zánětu MHCII+ monocyty exprimovaly vyšší množství proteinu tumor nekrotizujícího faktoru-α a IL-6 a mRNA Nos2 (inducibilní syntázy oxidu dusnatého) a že IL-6 byl zvýšen také v makrofázích (doplňkový obrázek S1c). Produkce IL-10 jak MHCII+ monocyty, tak makrofágy byla během zánětu také zvýšena (doplňkový obrázek S1c), což pravděpodobně odráží zánětem řízenou dráhu negativní zpětné vazby.

Bylo prokázáno, že kromě diferenciace v makrofágy se MHCII+ monocyty diferencují také v heterogenní podskupinu Ly6Clo CX3CR1int příbuznou makrofágům i klasickým DC.11 Mezi tímto heterogenním kompartmentem lze za homeostatických podmínek snadno odlišit CD11b+ DC (definované jako CD11c+ CD103- CD11b+ CX3CR1int buňky, šedá podmnožina) od makrofágů. CD11b+ DC exprimují MHCII, CD24 a CD11c, ale postrádají expresi CD64 a F4/80, markerů běžně spojovaných s makrofágy (obrázek 1d a doplňkový obrázek S1b). Rozdíl mezi makrofágy a CD11b+ DC se však během zánětu setřel výskytem populace exprimující CD64 (obr. 1d,e) a v současné době není jasné, jaký je ontogenetický a funkční vztah těchto buněk k ustáleným makrofágům nebo CD11b+ DC.

Během kolitidy korelovala výrazná akumulace MHCII+ monocytů se sníženou frekvencí makrofágů, CD11b+ DC a CD103+ DC (definovaných jako CD11c+ CD103+ CX3CR1- buňky, oranžová podskupina) mezi CD45+ buňkami lamina propria (obr. 1c,d). Absolutní počty však naznačovaly malý nárůst CD11b+ DC a CD103+ CD11b+ DC. Naproti tomu počty makrofágů zůstaly nezměněny a CD103+ CD11b- DC se mírně snížily (doplňkový obrázek S1a).

Celkově infekce Hh v přítomnosti blokády IL-10R vyvolává střevní zánět spojený s dramatickými změnami v myeloidním kompartmentu. Pozorovali jsme převažující akumulaci granulocytů a MHCII+ monocytů v lamina propria tlustého střeva. MHCII+ monocyty a makrofágy navíc získaly více prozánětlivý profil.

CD11c+ mononukleární fagocyty pohánějí kolitidu prostřednictvím produkce IL-23

Protože IL-23 byl v tomto modelu identifikován jako hlavní hnací síla kolitidy,23 zkoumali jsme dále funkční význam produkce IL-23 mononukleárními fagocyty pro rozvoj kolitidy v modelu Hh+anti-IL-10R. Proto jsme zkřížili myši exprimující zelený fluorescenční protein (GFP) a Cre rekombinázu pod kontrolou promotoru CD11c (kódovaného Itgax)25, 26 s myšmi, které mají dvě loxP místa lemující čtyři exony genu Il23a27 , a vytvořili tak myši Cd11c-cre.Il23afl/fl (CD11cIL-23-).

Jelikož myši CD11cIL-23- exprimují GFP pod kontrolou promotoru CD11c, a proto je nelze křížit s CX3CR1-GFP reportérovými myšmi, spoléhali jsme se při hodnocení myeloidního kompartmentu u těchto myší na alternativní strategii bránění (doplňkový obrázek S2). V ustáleném stavu měly CD11cIL-23- myši v tlustém střevě podobný počet leukocytů jako jejich IL-23-profesionální vrstevníci (CD11cIL-23+) (doplňkový obrázek S3a) a nebyly pozorovány žádné významné změny ve frekvenci myeloidních nebo T buněk (doplňkový obrázek S3b). Jelikož je však IL-23 nutný pro udržení diferencovaných Th17 buněk,28 vykazovaly CD11cIL-23- myši silně snížené hladiny IL-17+ a IL-17+ IFNγ+ CD4+ T buněk v tlustém střevě (doplňkový obrázek S3c).

Po infekci Hh a léčbě anti-IL-10R vykazovaly CD11cIL-23- myši nápadné snížení kolitidy ve srovnání s CD11cIL-23+ myšmi, se sníženou hyperplazií epitelu krypt a nižší infiltrací leukocyty v celém tlustém střevě a céku (obr. 2a,b). U CD11cIL-23- myší také nedošlo k rozvoji splenomegalie (obrázek 2c), což naznačuje, že byly rovněž chráněny před systémovými příznaky onemocnění. Snížená patologie pozorovaná u myší CD11cIL-23- nebyla důsledkem rozdílné bakteriální zátěže, protože úroveň kolonizace Hh byla u skupin CD11cIL-23- a CD11cIL-23+ podobná (obrázek 2d). V souladu se snížením patologických změn byly v tlustém střevě myší CD11cIL-23- po blokádě Hh a IL-10R silně sníženy vrozené i adaptivní efektorové cytokiny (obrázek 2e), stejně jako množství samotného IL-23 (obrázek 2f).

V souladu s jejich sníženou infiltrací leukocyty vykazovaly CD11cIL-23- myši sníženou frekvenci a počet jak MHCII-, tak MHCII+ monocytů (obrázek 3a) a neutrofilů (doplňkový obrázek S3d) v lamina propria po infekci Hh a blokádě IL-10R ve srovnání s podobně léčenými CD11cIL-23+ vrstevníky. Nižší infiltrace monocytů u CD11cIL-23- myší korelovala s vyšší frekvencí makrofágů v lamina propria, zatímco frekvence CD11b+ DC a CD103+ DC se nezměnila a absolutní počty byly sníženy (doplňkový obrázek S3d).

Protože IL-23 pohání střevní zánět přímým působením na T-buňky, podporuje jejich akumulaci a proliferaci v tlustém střevě,29 zkoumali jsme kompartment T-buněk tlustého střeva u CD11cIL-23- a CD11cIL-23+ myší během kolitidy. CD11cIL-23- myši vykazovaly nižší frekvenci CD4+ T buněk tlustého střeva ve srovnání se svými IL-23-profesionálními vrstevníky (obr. 3b). Zatímco u CD11cIL-23+ myší došlo k silné Th1/Th17 efektorové odpovědi charakterizované vznikem jedno- a dvouprodukčních IL-17A+/IFNγ+ T buněk, CD11cIL-23- myši vykazovaly pouze mírnou indukci odpovídajících cytokinů (obr. 3c).

Obecně absence kolitidy u CD11cIL-23- myší naznačuje, že produkce IL-23 CD11c-exprimujícími MNP hraje ve střevní zánětlivé odpovědi nezastupitelnou roli.

MHCII+ monocyty a makrofágy jsou hlavním zdrojem IL-23 při infekci H. hepaticus

Pro lepší pochopení sledu událostí spojených s rozvojem kolitidy u IL-23-proficientních myší jsme nejprve sledovali expresi IL-23 v leukocytech purifikovaných z lamina propria tlustého střeva. Exprese mRNA Il23a byla trvale detekovatelná 4-5 dní po zahájení kolitidy (obr. 4a), což naznačuje, že na časné produkci IL-23 v tlustém střevě se podílí tkáňově rezidentní a/nebo rychle mobilizovaná buněčná podskupina. Proto jsme pro další analýzy zvolili tento časový bod. Po 4 dnech po infekci Hh a léčbě anti-IL-10R vykazovaly CD11cIL-23+ myši zvýšenou infiltraci leukocytů v lamina propria ve srovnání s neinfikovanými kontrolními myšmi (obr. 4b). Tento příliv koreloval se zvýšeným počtem všech podskupin MNP v tlustém střevě (doplňkový obrázek S4a,b), stejně jako se zvýšenou frekvencí MHCII- i MHCII+ monocytů (obrázek 4c,d), neutrofilů (obrázek 4d), CD103+ CD11b- DC a CD103+ CD11b+ DC (obrázek 4e). Frekvence makrofágů a CD11b+ DC mezi celkovými leukocyty se však v tomto časovém bodě nezměnily (obrázek 4d).

Pro další charakterizaci myeloidních podskupin podílejících se na střevním zánětu závislém na IL-23 jsme zkoumali expresi GFP asociovanou s CD11c-Cre buňkami lamina propria od CD11cIL-23+ myší. Analýza CD45+ buněk potvrdila, že exprese Cre-GFP byla omezena na leukocyty exprimující CD11c na svém buněčném povrchu (obr. 4f), ale byla pozorována převážně u buněk CD11chi. Dále byla fluorescence GFP asociovaná s Cre pozorována pouze v MHCII+ buňkách (obr. 4g) a zajímavé je, že exprese mRNA Il23a byla omezena na Cre-GFP+ buňky (obr. 4h). Většina MNP lamina propria exprimuje vysoké hladiny CD11c (obrázek 1e a doplňkový obrázek S1b). Analýza odlišných myeloidních podskupin u CD11cIL-23+ myší ukázala, že exprese GFP spojená s CD11c-Cre byla zjištěna převážně mezi makrofágy, CD103+ CD11b- DC, CD103+ CD11b+ DC, (Obrázek 4i) a CD11b+ DC (není uvedeno). Kromě toho byla více než polovina MHCII+ monocytů pozitivní pro Cre-GFP, což naznačuje, že všechny tyto podskupiny mohou být potenciálním zdrojem IL-23. Naproti tomu exprese Cre chyběla u eozinofilů, neutrofilů a MHCII- monocytů (obr. 4i).

Pro charakterizaci toho, které z těchto subsetů představují funkční zdroj IL-23 in vivo, jsme hodnotili expresi mRNA Il23a odpovídajícími populacemi vytříděnými průtokovou cytometrií z CD11cIL-23- a CD11cIL-23+ myší 4 dny po infekci Hh v přítomnosti blokády IL-10R. Je pozoruhodné, že exprese mRNA Il23a v buňkách CD11cIL-23+ byla většinou omezena na MHCII+ monocyty a makrofágy, přičemž nízká exprese byla detekovatelná mezi CD103+ CD11b- DC a CD103+ CD11b+ DC (obr. 4j). Kromě toho byla exprese Il23a jak MHCII+ monocyty, tak makrofágy výrazně snížena u CD11cIL-23- myší, což naznačuje, že exprese CD11c-Cre byla aktivní v těchto buněčných podskupinách (obr. 4j). Nízká exprese Il23a pozorovaná u MHCII- monocytů (obr. 4k) naznačuje, že k indukci IL-23 dochází v lamina propria během jejich lokálního zrání a získávání MHCII.

Protože úroveň exprese CX3CR1 identifikuje diskrétní podskupiny MNP, zopakovali jsme naši analýzu u CX3CR1GFP/+ myší. U neinfikovaných myší byly zjištěny nízké hladiny konstitutivního Il23a mezi MHCII+ monocyty, CD103+ CD11b+ DC, (doplňkový obrázek S4c,d) a CD11b+ DC (doplňkový obrázek S4d). Zvýšená exprese Il23a ve 4 dnech po infekci Hh a blokádě IL-10R však byla konzistentně zjištěna pouze u MHCII+ monocytů (doplňkový obrázek S4d) a makrofágů (není uvedeno). V průběhu zánětu se vysoká exprese Il23a udržovala v MHCII+ monocytech a jejich vývojovém potomstvu, nikoli však v CD103+ DC (obr. 5a). Mezi podskupinami CX3CR1int byla exprese Il23a dále omezena na CD64+ buňky (Obrázek 5b).

Souhrnně naše údaje naznačují, že indukce IL-23 při kolitidě je obsažena v buňkách CD11c+ exprimujících CX3CR1, které rovněž exprimují MHCII a CD64.

CD103+ DC závislé na Batf3 jsou pro chronickou kolitidu nepostradatelné

CD103+ CD11b+ DC se nacházejí převážně v tenkém střevě myší a v tlustém střevě téměř chybí.6 Místo toho je většina CD103+ DC tlustého střeva CD11b- a pro svůj vývoj vyžadují transkripční faktor Batf3.30 Myši Batf3-/- tedy postrádají tkáňově rezidentní podskupiny CD8α+ a CD103+ CD11b- nelymfoidních DC. Jak se očekávalo, CD103+ CD11b- buňky byly v lamina propria tlustého střeva myší Batf3-/- silně redukovány, zatímco CD103+ CD11b+ DC nebyly ovlivněny (obr. 6a,b). Abychom posoudili, zda se CD103+ CD11b- DC mohou podílet na rozvoji kolitidy, infikovali jsme myši Batf3-/- Hh v kombinaci s léčbou anti-IL-10R. Po dvou týdnech od zahájení kolitidy byl počet CD103+ CD11b- DC v lamina propria stále významně snížen (Obrázek 6b), ale u Batf3-/- myší nebyly pozorovány žádné rozdíly v infiltraci leukocyty (Obrázek 6c) ani v závažnosti kolitidy (Obrázek 6d) ve srovnání s jejich protějšky divokého typu, což naznačuje, že Batf3-dependentní DC jsou pro indukci střevního zánětu řízeného IL-23 v tomto modelu nepostradatelné.

Zralé makrofágy produkují IL-23 v reakci na H. H. hepaticus in vitro, ale sdílejí funkční redundanci s MHCII+ monocyty in vivo

Pro rozluštění podílu makrofágů na produkci IL-23 jsme vytvořili makrofágy odvozené z kostní dřeně (BMDM) z CD11cIL-23- a CD11cIL-23+ myší. Po diferenciaci s médiem podmíněným buňkami L929 byla přibližně polovina BMDM pozitivní na Cre-GFP a exprimovala CD64, F4/80 a CD11c (doplňkový obrázek S5a). BMDM byly stimulovány in vitro živými Hh bakteriemi v přítomnosti protilátky anti-IL-10R a jejich odpověď byla porovnána s příslušnými kontrolami. Je pozoruhodné, že stimulace CD11cIL-23+ BMDMs Hh vedla k expresi mRNA Il23a a tato odpověď byla zesílena v přítomnosti blokády signalizace IL-10R, zatímco Il23a nebyl exprimován nestimulovanými BMDMs nebo těmi, které byly ošetřeny pouze protilátkou anti-IL-10R (doplňkový obrázek S5b). Podobně infekce myší Hh vyvolala u monocytů a makrofágů in vivo pouze nízký výbuch IL-23 a tato odpověď byla silně zvýšena v nepřítomnosti signalizace IL-10R (doplňkový obrázek S5c). 8.

Střevní tkáňové makrofágy pocházejí výhradně z krevních monocytů a neobnovují se samy, 10 Signalizace receptoru pro faktor stimulující kolonie 1 (CSF-1R) řídí diferenciaci Ly6Chi na monocyty Ly6Clo31 a je nutná pro zrání a náhradu monocytů rezidentního typu Ly6Clo a tkáňových makrofágů, ale je nepotřebná pro produkci monocytů Ly6Chi nebo zánětlivou funkci.32 Abychom posoudili relativní podíl MHCII+ monocytů a tkáňových makrofágů na rozvoji střevního zánětu závislého na IL-23, před indukcí kolitidy jsme CX3CR1GFP/+ myši předléčili anti-CSF-1R blokující mAb nebo izotypovou kontrolou. Skupina myší byla analyzována v den 0 (doplňkový obrázek S6a,b), zatímco zbývající myši byly léčeny Hh a anti-IL-10R a pokračovaly v léčbě anti-CSF-1R. Po 4 dnech po infekci Hh a léčbě anti-IL-10R se makrofágy v tlustém střevě myší léčených anti-CSF-1R téměř nevyskytovaly. Heterogenní Ly6Clo CX3CR1int makrofágový/DC kompartment byl u těchto myší také významně snížen (obr. 7a,b a doplňkový obrázek S6c). Ačkoli se celkový počet leukocytů v tlustém střevě nezměnil (obrázek 7c), došlo za těchto podmínek ke zvýšení podílu granulocytů (obrázek 7d). Zajímavé je, že deplece makrofágů dále korelovala se zvýšenou expresí Il23a v lamina propria ve 4. dni (obrázek 7e). Anti-CSF-1R zprostředkovaná deplece makrofágů v celém průběhu kolitidy však neovlivnila počet zánětlivých buněk hromadících se v tlustém střevě (obrázek 7f) ani závažnost střevní patologie (obrázek 7g) 2 týdny po infekci Hh a blokádě signalizace IL-10R, což naznačuje, že MHCII+ monocyty a makrofágy mohou během zánětu vykazovat funkční redundanci.

.