Chloridové iontové kanály a transportéry: od kuriozit přírody a zdroje lidských nemocí k cílům léčiv

To uspokojí prakticky všechny případy od učebny až po výzkumnou laboratoř, dokud neuvažujeme o chloridových kanálech. Víme, že existují, jsou důležité a mohly by být dobrým cílem pro léčiva v několika oblastech onemocnění, ale donedávna zůstávaly ve světě terapie poněkud stigmatizované a nemoderní. Nedostatek selektivních ligandů tomu vůbec nepomohl. Jedinou výjimkou byl receptor GABA-A, který je spojen s vnitřním chloridovým kanálem, jenž se otevírá po vazbě inhibičního neurotransmiteru GABA. Benzodiazepiny tento receptor potencují od doby, kdy bylo v 60. letech 20. století k dispozici Valium, a poskytují mu sedativní a antikonvulzivní účinky. To zavádí důležitý koncept: existuje několik rodin genů a různých typů proteinů, které lze popsat jako chloridové kanály.

To je na rozdíl od toho, co chápeme u kationt-selektivních iontových kanálů, kde je malá flexibilita ve struktuře proteinu, která může vytvořit pór selektivní pro draslík, sodík nebo vápník; rozmanitost těchto iontových kanálů je způsobena variacemi v proteinových doménách odlišných od póru, které ovlivňují chování při otevírání a zavírání. Abychom byli spravedliví, nezdá se, že by existovalo mnoho fyziologických důvodů, proč by měl aniontový kanál vykazovat chloridovou selektivitu, protože fyziologická úloha v membránovém transportu jiných halogenidů nebo malých aniontů je malá; jakýkoli aniontový kanál bude z fyziologického hlediska standardně chloridovým kanálem. Na druhou stranu draslíkové, sodíkové a vápníkové membránové proudy hrají každý jinou základní roli a selektivní propustnost membrány pro tyto kationty je klíčová pro buněčnou funkci a vlastně i pro život samotný.

GABA-A receptory jsou členy rodiny pentamerických ligandem řízených iontových kanálů s cys smyčkou, která zahrnuje několik typů excitačních a inhibičních neurotransmiterových kanálů. Protein CFTR (cystická fibróza – cystic fibrosis transmembrane regulator) je nukleotidy regulovaný chloridový kanál. Je členem rozmanité rodiny ABC (ATP-binding cassette) transportérů a jako jediný zřejmě nepřenáší přes membránu žádný substrát, ale funguje jako chloridový kanál. Rodina CLC napěťově řízených chloridových kanálů vzniká z jiné odlišné rodiny genů a má obecnou strukturu jedinečnou mezi membránovými proteiny. Tato rodina proteinů přinesla za posledních 30 let mnoho překvapení a členové této rodiny zde budou představeni a také to, jak by mohli být považováni za cíle léčiv.

Další zajímavé novinky z oblasti chloridových kanálů se objevily po molekulární identifikaci proteinů, které jsou základem chloridových kanálů aktivovaných vápníkem (ClCa). Z funkčního hlediska známe jejich fyziologické role již delší dobu, ale nedávná molekulární identifikace proteinů kanálů umožnila vývoj molekulárních a farmakologických nástrojů pro zkoumání a změnu jejich aktivity. Tento přehled se zaměřuje na farmakologický potenciál cílení na kanály ClCa a proteiny CLC; jejich funkce a subcelulární lokalizace jsou shrnuty na obrázku 1.

Úvod do proteinů CLC

Devět členů této rodiny proteinů jsou CLC-1 až 7, CLC-KA a KB. Zakládající člen, CLC-1, je napěťově řízený chloridový kanál kosterního svalu a bude o něm pojednáno níže. Mnoho funkčních studií bylo provedeno na homologu s čestným názvem CLC-0, izolovaném z elektrického orgánu Electroplax, který umožňuje rejnokovi omračovat své vodní oběti. Rekonstituce CLC-0 do lipidových dvojvrstev a elektrofyziologický záznam proudů tekoucích jednotlivými iontovými kanály odhalily zajímavou vlastnost. Obvykle se při záznamu proudu z malého kousku membrány obsahujícího jediný iontový kanál pozorují fluktuace mezi dvěma amplitudami proudu: jedna představuje uzavřený kanál a druhá proud tekoucí otevřeným kanálem. Tyto fluktuace odrážejí přechody mezi otevřeným a uzavřeným kinetickým stavem. U CLC-0 však bylo zřejmé, že protein jediného iontového kanálu se skládá ze dvou rovnocenných pórů, které se mohou otevírat nezávisle na sobě1. Tento kanál byl proto popsán jako dvouhlavňový (obrázek 2). Nebylo tedy velkým překvapením, že krystalové struktury homologů z enterických bakterií odhalily, že proteinový komplex je dimer, přičemž každá podjednotka má iontově vodivou dráhu2 (obr. 2).

Druhé překvapení nastalo, když byly provedeny podrobné funkční experimenty s CLC-ec1 z E. coli. Spíše než aby fungoval jako chloridový kanál, jako jeho dávno ztracený příbuzný v kosterním svalstvu obratlovců, je CLC-ec1 výměnný transportér 2Cl-/H+ neboli antiportér s přísnou stechiometrií výměny 2:13 . Tento protein je důležitý pro přežití střevních bakterií při nízkém pH4 a pravděpodobně využívá gradientu chloridů k udržení buněčného pH na přijatelné úrovni. Prokaryotické CLC by proto mohly být cílem inhibitorů pro léčbu patogenních infekcí E. coli nebo salmonel4. Objev iontově výměnného chování přirozeně podnítil další snahy zjistit, zda nějaká taková výměna chloridů za protony existuje i u savčích CLC, a to za předpokladu, že výměna Cl-/H+ může být skutečnou funkcí archetypálních CLC a ty, které byly identifikovány jako chloridové kanály, mohou být jen výjimkou z pravidla. Zdá se, že tomu tak je, protože existují přesvědčivé důkazy, že CLC-3 až CLC-7 fungují jako 2Cl-/H+ výměnné transportéry, které se primárně nacházejí v intracelulárních organelách, zatímco CLC-1, CLC-2, KA a KB jsou skutečné chloridově vodivé iontové kanály plazmatické membrány5-9 . Protože archetypální vlastností CLC je výměnný transport, který se vyskytuje ve všech formách buněčného života, lze proto poslední podtřídu proteinů, bona fide chloridové kanály, považovat za „rozbité“ chloridové transportéry, které ztratily vazbu chloridového transportu na pohyb druhého substrátového iontu.

CLC-1

Tento zakladatel rodiny CLC je napěťově řízený chloridový kanál kosterního svalu a slouží k regulaci membránového potenciálu a repolarizaci membrány po akčních potenciálech k relaxaci svalu. Ve většině tkání bychom očekávali, že tuto roli budou hrát draslíkové kanály, což dělají v srdečním a hladkém svalu, a také regulují vzrušivost membrány v jiných typech buněk. Systém příčných kanálků je prodloužením plazmatické membrány (sarkolemy) a proniká do kontraktilní tkáně. Je rozhodující pro rychlé šíření elektrické aktivity v celém svalu a organizuje rychlou a kontrolovanou kontrakci. Odtok draslíku ze svalových buněk do uzavřeného prostoru t-tubulu by zvýšil extracelulární koncentraci draslíku a zhroutil tento iontový gradient, což by vedlo k prodloužené depolarizaci membrány. Chloridové kanály, které hrají převažující repolarizační roli, tomu zabraňují. Ztráta funkce mutací CLC-1 vede k myotonii u člověka, koz a myší (nedávný přehled viz10) a je charakterizována zhoršenou svalovou relaxací, což odpovídá ztrátě repolarizačního membránového proudu.

S expresí omezenou na kosterní svalstvo by CLC-1 mohl být atraktivním cílem pro léky, které řídí svalovou kontrakci zvýšením nebo snížením funkce CLC-1, a tím snižují, resp. zvyšují svalovou excitabilitu. Sloučeniny, které zvyšují funkci CLC-1, by mohly být schopny léčit myotonii, zejména v případech, kdy by mohly kompenzovat částečnou ztrátu aktivity chloridových kanálů. Inhibice CLC-1 by mohla snížit práh svalové kontrakce a mohla by být užitečná v případech svalové slabosti nebo degenerativních onemocnění, jako je svalová dystrofie.

CLC-2

Chloridový kanál s vnitřní korekcí, CLC-2, má poněkud širokou tkáňovou distribuci. Lze jej nalézt v centrálních neuronech, kde reguluje neuronální aktivitu11-13 . V astrocytech je jeho subcelulární zacílení na buněčné spoje regulováno interakcí s GlialCAM (MLC1), jehož mutace toto zacílení narušují a způsobují megalencefalickou leukoencefalopatii14. Nejnovější terapeutické zájmy zahrnují expresi CLC-2 ve střevní sliznici a plicních bronchiolech, kde hraje roli ve střevní, respektive plicní sekreci. Bylo navrženo, že lubiproston, lék používaný klinicky ke zmírnění zácpy, uplatňuje svůj účinek aktivací CLC-2, ale tento účinek je sporný. Zatímco v některých studiích tato sloučenina aktivuje kanály CLC-2, v jiných reguluje obchodování s CLC-2 a zvyšuje funkci CFTR prostřednictvím aktivace prostaglandinových receptorů15,16 . Stále však existuje dostatek důkazů, že zvýšení funkce CLC-2 v dýchacích cestách by mohlo poskytnout alternativní chloridovou cestu u cystické fibrózy17.

CLC-KA/KB

Tyto chloridové kanály jsou exprimovány zejména v ledvinových epitelích a přispívají k propustnosti buněčných membrán pro pasivní tok chloridů. Mají klíčovou úlohu ve vzestupném raménku a distálních tubulech nefronu, kde zajišťují bazolaterální cestu pro reabsorpci chloridů po transportu z primární moči přes apikální membránu. Gen CLCKB, který kóduje CLC-KB, je jedním z pěti genů, které jsou základem Bartterova syndromu. Ztráta funkce mutací v CLC-KB má za následek defektní reabsorpci chloridů, a vede tak k poruše nedostatku soli, která je spojena s polyurií. Jedním z hlavních znaků jedinců, kteří jsou postiženi mutacemi CLC-KB (Bartterův typ III), je nízký krevní tlak. Závažnější formu onemocnění způsobují mutace v genu BSND (Bartterův typ IV), který kóduje Barttin, akcesorní protein důležitý pro přenos CLC-KA i KB do plazmatické membrány18. Tato forma poruchy zahrnuje také senzorickou hluchotu, o níž se předpokládá, že je způsobena ztrátou přenosu CLC-KA i KB do epiteliálních membrán ve vnitřním uchu. Sluchový systém pravděpodobně toleruje ztrátu aktivity buď CLC-KA, nebo KB, ale ne obou. To naznačuje, že inhibitory selektivní pro CLC-KA nebo CLC-KB nebo částečná inhibice obou mohou působit jako nová kličková diuretika s potenciálem snižovat krevní tlak a s malými vedlejšími účinky. To vedlo ke studiu jejich farmakologie a vývoji nových derivátů inhibitorů s nízkou mikromolární afinitou19 , které měly diuretické účinky při podávání potkanům20. Na druhou stranu léky, které aktivují kanály CLC-KB, mohou zvýšit zbytkovou aktivitu defektních kanálů u pacientů s Bartterovým typem III.

CLC-7

Z podtřídy 2Cl-/H+ výměnných transportérů je CLC-7 slibným cílem pro působení léků a jeho inhibice může být prospěšná u osteoporózy. Tato indikace opět vychází z pozorování lidského onemocnění způsobeného ztrátou funkce mutací v CLC-7, které způsobují osteropetrózu21. Při této poruše dochází k nedostatečné remodelaci kostí osteoklasty, což je pravděpodobně způsobeno vadnou sekrecí kyselin a enzymů. To vede k hutné kosti, která by v případě reprodukce inhibitorem CLC-7 mohla snížit rozpouštění kosti, a tím posílit kostru pacientů s osteoporózou22,23. V průkazných studiích farmakologická inhibice acidifikace24 nebo narušení funkce CLC-7 protilátkami25 snížily kostní resorpci. Inhibice CLC-7 však nemusí být bez komplikací, protože studie na lidech a myších naznačují, že nedostatek funkce CLC-7 může být také spojen s poruchami ukládání a degenerace neuronů v důsledku snížené lysozomální funkce26.

Loss-of-function human mutations – lessons from CFTR

Na tomto místě stojí za krátkou pauzu úvaha, že některé z terapeutických indikací pro nové léky cílené na CLC jsou zaměřeny na léčbu poruch odlišných a na opačném konci spektra než ty, které jsou způsobeny defektní funkcí CLC. Kromě výše popsaných onemocnění je Dentova choroba I onemocněním ledvin vázaným na chromozom X, které je způsobeno ztrátou funkce CLC-5 (nedávný přehled viz27 ). Ve všech případech se jedná o vzácné dědičné poruchy a hlavní defekt proteinu zahrnuje buď sníženou aktivitu proteinu, nebo jeho přenos na cílovou membránu. Ve skutečnosti mnoho jednotlivých mutací způsobuje zadržování ER a nedostatečné zrání proteinu. Paralelu bychom mohli najít u cystické fibrózy, kde většina postižených jedinců má mutaci ΔF508 zadržující ER. Nedávné a stratifikované přístupy k léčbě cystické fibrózy jsou výsledkem dvojího útoku, jehož cílem je opravit skládání mutovaných proteinů (CF korektory) a/nebo zvýšit aktivitu chloridových kanálů CFTR na plazmatické membráně (CF potenciátory). Úspěchy se objevují u třídy potenciátorů28 , které jsou účinné u pacientů s mutacemi, které snižují aktivitu CFTR bez ztráty biosyntézy nebo transportu proteinu (např. G551D), nicméně účinnost korektorů skládání (která je nutná ve většině případů) ještě nebyla stanovena29. Přestože všechna onemocnění spojená se ztrátou funkce CLC jsou vzácné genetické poruchy, je možné, že jednoho dne budeme schopni léčit jedince s myotonií, Bartterovým syndromem, Dentovou chorobou a osteopetrózou, stejně jako s cystickou fibrózou léky, které korigují skutečnou příčinu jejich poruchy.

Chloridové kanály aktivované vápníkem

Nakonec se zmíníme o chloridových kanálech aktivovaných vápníkem (ClCa), které mají jasně definovanou fyziologickou roli v řadě typů buněk, přesto jejich molekulární identifikace utrpěla několik falešných a zadrhnutých startů. Příběh zahrnuje čtyři typy proteinů: členy genových rodin CLCA, Bestrophin, Tweety a TMEM16. Ve všech případech vedla jejich rekombinantní nadměrná exprese ke vzniku membránových chloridových proudů, které jsou stimulovány zvýšením intracelulární koncentrace vápníku a v různé míře i depolarizací membrány. Cesta za CLCA skončila, když se zjistilo, že se jedná o protein, který je vylučován, ale pravděpodobně také reguluje membránovou expresi ClCa kanálů endogenních pro expresní systém30. Proteiny Tweety a Bestrophin nevykazují všechny vlastnosti kanálů ClCa studované v hlavních tkáních, ačkoli se zdá, že Best1 je zodpovědný za složku ClCa v senzorických neuronech31 a může být také důležitým regulátorem uvolňování vápníku z endoplazmatického retikula32,33. Tři nezávislé studie navrhly TMEM16A (označovaný také jako Ano1) jako kandidáta na hlavní složku, ne-li celou, pro chloridový kanál aktivovaný vápníkem34-36 . Mnoho následných studií, usnadněných vytvořením molekulárních nástrojů, to podpořilo. TMEM16A je důležitý pro regulaci membránové excitability v hladké svalovině cév, je upregulován ve zvířecím modelu plicní hypertenze a tonus lze snížit inhibicí kanálu37,38. V senzorických neuronech TMEM16A spojuje přítomnost zánětlivých mediátorů s hyperexcitabilitou membrán a inhibice TMEM16A má antinociceptivní účinky39. U zvířecích modelů astmatu je exprese tohoto konkrétního chloridového kanálu zvýšená a jeho inhibice může mít příznivé účinky40. Nachází se také v intersticiálních buňkách Cajalova střeva a funkce kanálu je nezbytná pro rytmickou kontrakci hladké svaloviny ve střevní stěně41. Kromě toho může aktivace TMEM16A poskytovat alternativní cestu pro epiteliální sekreci chloridů u cystické fibrózy42. Zatímco o přesné funkci ostatních členů rodiny TMEM16 se stále vedou diskuse, funkce ClCa byla přisouzena také TMEM16B (Ano2), o němž se předpokládá, že je základem kanálu ClCa v čichových vláskových buňkách43,44 . Tato třída iontových kanálů může hrát roli také v biologii nádorových buněk a její inhibice může zabránit proliferaci buněk45-48.

Závěrečné poznámky

Tento přehled poukázal na rozmanité role chloridových vodivých nebo transportních proteinů a na to, jak je jejich dysfunkce spojena s lidskými poruchami nebo příznaky podobnými onemocnění na zvířecích modelech. Je velký nedostatek farmakologických činidel, která inhibují, aktivují nebo zlepšují membránový přenos chloridových kanálů a transportérů. Pokroku se dosahuje u léků, které zvrátí defektní funkci CFTR u cystické fibrózy, což snad vyústí v léky specifické pro různé typy dědičných mutací. Inhibitory a aktivátory chloridových kanálů aktivovaných vápníkem TMEM16A42,49 se ukazují jako užitečné laboratorní nástroje a nové sloučeniny by mohly být účinnými léky, zejména pokud budou schopny zajistit tkáňově specifické účinky. Molekuly specifické pro konkrétní CLC jsou pravděpodobně nejobtížnější. Pochopení strukturního základu aktivace napěťově řízených CLC50 by mohlo identifikovat proteinové domény, na které lze cílit pomocí racionálního strukturního návrhu léčiv. Takové nástroje nám umožní vyzkoušet některé z nových terapeutických nápadů, které zde byly přezkoumány a představeny.

Životopis autora

Dr Jon Lippiat absolvoval doktorské studium struktury, funkce a farmakologie draslíkových kanálů na univerzitě v Leicesteru. Před svým jmenováním lektorem farmakologie na univerzitě v Leedsu studoval funkci beta-buněk pankreatu a diabetes na univerzitě v Oxfordu. Jeho výzkum zahrnuje objasnění strukturních a fyziologických vlastností několika různých typů iontových kanálů a transportérů a jejich potenciální zacílení pomocí nových farmakologických činidel.