5 Regulace nitrobuněčných koncentrací aniontů
Regulace chloridů závisí na koordinaci několika procesů (obr. 2). Bylo navrženo, že některé chloridové únikové kanály snižují intracelulární koncentraci chloridů tím, že fungují jako jednosměrné ventily. Tato myšlenka vychází z pozorování, že chloridové kanály jako ClC-2 (gen clcn2) jsou propustnější pro chloridy vystupující z buňky než pro chloridy vstupující do buňky.35 Bez ohledu na tuto rozdílnou propustnost, která se označuje jako rektifikace, směr toku chloridů stále závisí na hnací síle chloridů. To znamená, že chloridy budou mít jen zřídka, pokud vůbec, možnost opustit buňku prostřednictvím ClC-2, protože chloridová hnací síla je téměř vždy v opačném směru. Protože je „ventil“ nedokonalý, kanály ClC-2 ve skutečnosti propouštějí chloridy do buňky.36
Neschopnost kanálů propouštět chloridy z buňky zdůrazňuje potřebu různých mechanismů přenosu iontů, které mohou přesouvat chloridy proti jejich gradientu.37 Kotransportéry neboli symportéry přesouvají přes buněčnou membránu dva nebo více druhů iontů ve stejném směru; chloridy se mohou pohybovat proti svému gradientu tím, že se připojí k jinému iontu, který se pohybuje po svém gradientu. Výměníky neboli antiporty dělají v podstatě totéž, ale spojují pohyb iontových druhů, které proudí přes membránu opačným směrem. Hlavním extrudérem chloridů v neuronech je draslíko-chloridový kotransportér 2 (KCC2) (gen slc12a5). KCC2 umožňuje chloridům přenášet draselné ionty, které proudí po jejich gradientu dolů a ven z buňky. Tento proces je elektroneutrální, protože stechiometrie chloridu a draslíku je 1:1. Proces není aktivní, protože nezahrnuje přímo hydrolýzu ATP (a proto by neměl být označován jako pumpování); místo toho je proces sekundárně aktivní, protože KCC2 spoléhá na draslíkový gradient, který je udržován sodíko-draslíkovou ATPázou, která pumpuje draslík do buňky.
Dalším důležitým činitelem, který se podílí na homeostáze chloridů v neuronech, je sodíko-draslíko-chloridový kotransportér 1 neboli NKCC1 (gen slc12a2). NKCC1 využívá sodíkový gradient k přesunu draslíku a chloridů do buňky, což vede k vysoké intracelulární koncentraci chloridů. To je samozřejmě opak toho, jak KCC2 ovlivňuje chloridy. Relativní exprese NKCC1 a KCC2 tedy určuje intracelulární koncentraci chloridů, nehledě na účinky zatížení chloridy prostřednictvím různých chloridových kanálů včetně aktivovaných GABAA a glycinových kanálů. Je třeba upozornit na několik bodů. Za prvé, NKCC1 je silně exprimován na počátku vývoje, zatímco KCC2 je exprimován pouze slabě, ale dochází k vývojovému přepnutí, které vede k inverznímu vzorci v dospělosti.38,39 V míšním dorzálním rohu potkana se zdá, že Eanion dosahuje své zralé hodnoty přibližně 2 týdny po narození40 , ale plné schopnosti extruze chloridů je dosaženo až 3-4 týdny po narození41; jinými slovy, zátěž chloridy snadněji převáží extruzi chloridů zprostředkovanou KCC2 v mladých neuronech. Zadruhé, k vývojovému přepnutí nedochází v primárních aferentních neuronech, což znamená, že hladiny NKCC1 zůstávají vysoké, což vede k vysokým intracelulárním koncentracím chloridů v těchto buňkách42,43 . Zatřetí, NKCC1 a KCC2 nejsou ani v rámci jednoho neuronu exprimovány rovnoměrně, což může vést k vysoké intracelulární koncentraci chloridů v jednom kompartmentu (např. v počátečním segmentu axonu) a nízké intracelulární koncentraci chloridů v jiných kompartmentech (např. v somatu a dendritech).44,45 A konečně normální úroveň exprese KCC2 v dospělosti může být patologicky změněna (oddíl 8).
Je třeba se zmínit o způsobu provádění elektrofyziologických záznamů, protože to může (úmyslně nebo neúmyslně) vést ke změnám intracelulární koncentrace chloridů. Při technice celobuněčných patch clampů se po utěsnění patch pipety k buněčné membráně protrhne buněčná membrána, aby se získal elektrický přístup do buňky; následně je cytosol dialyzován roztokem pipety. Roztok pipety je často navržen tak, aby měl koncentraci chloridů blížící se přirozené intracelulární úrovni, ale někdy má záměrně vysokou koncentraci chloridů, aby se zvýšila hnací síla chloridů (např. pro usnadnění detekce malých inhibičních postsynaptických proudů). Oba přístupy jsou přijatelné v závislosti na položené otázce. V obou případech však dialýza buňky znamená, že intracelulární chlorid je účinně uzavřen na úrovni chloridu v roztoku pipety nebo blízko ní, což samozřejmě není vhodné pro měření přirozené hladiny chloridu v buňce. Tento problém lze vyřešit použitím techniky perforované záplaty.46 Přesto lze dialýzu buňky použít k testování schopnosti vytlačování tím, že se zjistí, zda se intracelulární koncentrace chloridů vyrovnává s koncentrací v pipetě, nebo zda se buňce daří udržovat nižší hladinu díky svým vytlačovacím mechanismům.47,48 Při napěťové svorce se navíc náhle mění membránový potenciál a udržuje se na libovolně zvolených hodnotách, což může vést k velmi nepřirozeným hnacím silám chloridů. Jak vysvětlují Ratté a Prescott,36 takové experimentální detaily je třeba pečlivě zvážit, aby se předešlo chybným interpretacím.
Jak již bylo zmíněno, bikarbonát vytéká přes aktivované GABAA a glycinové receptory. Pravděpodobnost, že odtok bikarbonátu způsobí extracelulární akumulaci, je vzhledem k relativně neomezené difuzi bikarbonátu v extracelulárním prostoru nízká, ale odtok bikarbonátu může vyčerpat intracelulární hladinu bikarbonátu a způsobit pokles pH.49 K tomu však za normálních podmínek zpravidla nedochází, protože intracelulární hydrogenuhličitan je doplňován přeměnou oxidu uhličitého a vody na hydrogenuhličitan a protony enzymem karboanhydrázou; oxid uhličitý jako plyn volně difunduje přes buněčnou membránu. Intracelulární hydrogenuhličitan lze vyčerpat (a tím omezit jeho odtok) blokádou karboanhydrázy acetazolamidem32 , který může mít ve skutečnosti analgetické účinky (oddíl 9). Regulace pH zahrnuje další chemické reakce a transportní mechanismy a samotný hydrogenuhličitan může být přesunut přes buněčnou membránu výměnou za chlorid50
.