Laine se začala profesionálně věnovat zpěvu až po dvacítce. Jejími ranými pěveckými vlivy byly Ella Fitzgerald, Sarah Vaughan, Judy Garland a Lena Horne. Ve svých 24 letech se úspěšně zúčastnila konkurzu do malé skupiny Johna Dankwortha, Dankworth Seven, a později do jeho orchestru, se kterým vystupovala až do roku 1958. Dankworth a Laineová se toho roku tajně vzali na matrice v Hampsteadu. Jedinými svědky byli jejich přítel, pianista Ken Moule, a Dankworthův aranžér David Lindup. Manželé měli dvě děti, které jsou obě úspěšnými hudebníky: Alec, který žije v USA, a Jacqui, britská zpěvačka, která vydala řadu alb.
Hrála hlavní roli v nové hře v londýnském divadle Royal Court, kde v 50. letech působila nová vlna dramatiků, jako byli John Osborne a Harold Pinter. To vedlo k dalším jevištním vystoupením, například v muzikálu Valmouth v roce 1959, ve hře A Time to Laugh (s Robertem Morleym a Ruth Gordonovou) v roce 1962, v Boots With Strawberry Jam (s Johnem Nevillem) v roce 1968 a nakonec k roli Julie La Verneové v inscenaci Show Boat Wendy Toyeové v Adelphi Theatre v Londýně v roce 1971. Show Boat měla v této londýnské sezóně doposud nejdelší trvání – 910 odehraných představení.
V tomto období zaznamenala dva velké nahrávací úspěchy. Skladba „You’ll Answer to Me“ se dostala do britské Top 10, zatímco Laine byla „primadonou“ v inscenaci opery/baletu Sedm smrtelných hříchů Kurta Weilla v režii a choreografii Kennetha MacMillana na Edinburském festivalu v roce 1961. V roce 1964 bylo dobře přijato její album Shakespeare and All that Jazz s Dankworthem. Dankworth a Laineová založili v roce 1970 divadlo Stables v budově starých stájí v areálu svého domu. Okamžitě zaznamenalo úspěch, během prvního roku odehrálo 47 koncertů.
Laininy mezinárodní aktivity začaly v roce 1972 prvním úspěšným turné po Austrálii, kde v průběhu 70. let vydala šest alb, která se dostala do první stovky hitparád. Krátce poté byla zahájena její kariéra ve Spojených státech koncertem v newyorském Lincolnově centru a v roce 1973 následovalo první z mnoha vystoupení v Carnegie Hall. Brzy následovala turné po USA a Kanadě od pobřeží k pobřeží a s nimi řada gramofonových desek a televizních vystoupení, včetně The Muppet Show v roce 1977. To vedlo po několika nominacích k jejímu prvnímu ocenění Grammy, které získala za živý záznam svého koncertu v Carnegie v roce 1983. I nadále pravidelně koncertuje, mimo jiné v roce 2005 v Austrálii.
Spolupracovala s Jamesem Galwayem, Nigelem Kennedym, Julianem Lloydem Webberem a Johnem Williamsem. Dalšími významnými nahrávkami v tomto období byla alba duetů s Rayem Charlesem (Porgy and Bess) a také Pierrot Lunaire Arnolda Schoenberga, za které získala nominaci na cenu Grammy.
Lainin vztah k hudebnímu divadlu začal v Británii a pokračoval ve Spojených státech hlavními rolemi v Sondheimově Malé noční hudbě a Veselé vdově Franze Lehára (Michigan Opera). V roce 1980 hrála v Dankworthově muzikálu Colette. Představení začalo v roce 1979 v divadle Stables ve Wavendonu a v září 1980 bylo přeneseno do Comedy Theatre v Londýně. V roce 1985 ztvárnila roli princezny Pufferové v broadwayském muzikálu The Mystery of Edwin Drood, za kterou byla nominována na cenu Tony. V roce 1989 získala uznání losangeleské kritiky za ztvárnění Čarodějnice v Sondheimově hře Into the Woods.
V květnu 1992 Laineová vystoupila s Frankem Sinatrou na týdenním koncertu v londýnské Royal Albert Hall.
Koncem 90. let byly Laineové koncerty vyprodané po celém světě, obvykle je podporoval Dankworth se svou kapelou, orchestrem nebo menší skupinou. Její obvyklou kapelu tvořili John Horler (klavír), Alec Dankworth (baskytara), Allan Ganley (bicí) a Mark Nightingale (trombon).
Laineova autobiografie Cleo vyšla v září 1994 v nakladatelství Simon & Schuster. Její druhá kniha, You Can Sing If You Want To, vyšla v říjnu 1997 v nakladatelství Victor Gollancz. V roce 2000 se objevila jako zpěvačka Gwen ve filmu The Last of the Blonde Bombshells.
Na novoročním seznamu vyznamenání v roce 1997 se Laine stala Dame Commander a byla jmenována Dame Cleo Laine DBE. Na novoroční listině vyznamenání za rok 2006 byl její manžel jmenován rytířem bakalářem a stal se sirem Johnem Dankworthem. Byli jedním z mála párů, kde oba partneři měli své tituly samostatně, a jediným párem v jazzu, který byl takto oceněn.
Dankworth zemřel 6. února 2010, několik hodin před plánovaným koncertem v divadle Stables ve Wavendonu u příležitosti 40. výročí jeho založení. Po koncertním turné ve Spojených státech byl několik měsíců nemocný. Navzdory svému zármutku Laine na koncertě ke 40. výročí vystoupil spolu s Big Bandem Johna Dankwortha a několika členy své rodiny – jeho smrt oznámil až na konci. Laineho rozhodnutí vystoupit se objevilo na titulních stranách novin po celém světě, včetně její celé fotografie na titulní straně deníku The Times.
Týden po Dankworthově smrti Laine zaskočil za svého zesnulého manžela a znovu vystoupil na koncertě v Pinneru v severozápadním Londýně. V měsících následujících po Dankworthově smrti Laine nadále vystupovala a poskytovala rozhovory. V červnu a červenci 2010 vystoupila jako hlavní hvězda festivalu Music in the Garden ve Wavendonu.
V březnu 2010 vyšla na CD a ke stažení poslední hudební spolupráce Laine a Dankwortha – Jazz Matters. Na nahrávce hrál Dankworthův Big Band nové skladby, které Dankworth napsal pro vystoupení dvojice na festivalu Proms v Royal Albert Hall v roce 2007.
Laine je proslulá nejen svým interpretačním stylem, ale také téměř čtyřoktávovým rozsahem a hlasovou přizpůsobivostí. Kromě toho, že Laine trefuje hluboké soulové tóny, se jejím poznávacím znamením stal scatting a nejvyšší tóny. Ačkoli má přirozený rozsah kontraaltu, je schopna vyloudit i G nad vysokým C. Derek Jewel ze Sunday Times ji označil za „jednoduše nejlepší zpěvačku na světě“.
.