Chcete začít používat krevní vzorky ve svém translačním výzkumu? Možná se zajímáte o metastazující rakovinu prsu nebo nemalobuněčnou rakovinu plic. Nebo vás možná problémy a omezení vzorků solidních nádorů přivedly k myšlence… je čas.
Teď co?“
Podívejme se blíže na výtěžnost DNA a na realitu práce s bezbuněčnou DNA z plazmy. Bezbuněčná DNA (nebo cfDNA) označuje veškerou neobalenou DNA v krevním řečišti. Část této bezbuněčné DNA pochází z nádorového klonu a nazývá se cirkulující nádorová DNA (nebo ctDNA). cfDNA jsou fragmenty nukleových kyselin, které se dostávají do krevního oběhu během apoptózy nebo nekrózy. Za normálních okolností jsou tyto fragmenty uklizeny makrofágy, ale domníváme se, že přemnožení buněk u rakoviny zanechává více cfDNA. Tyto fragmenty mají průměrnou délku kolem 170 bází, poločas rozpadu přibližně dvě hodiny a jsou přítomny v časných i pozdních stadiích onemocnění u mnoha běžných nádorů včetně nemalobuněčných nádorů plic a prsu. Koncentrace cfDNA se přitom značně liší a vyskytuje se v rozmezí 1 až 100 000 fragmentů na mililitr plazmy.
Pokud se již nějakou dobu zabýváte sekvenováním nové generace, možná vás zajímají informace o citlivosti a specifičnosti. Prokázali jsme vysokou citlivost a specifičnost pro varianty s frekvencí vyšší než bodové jedno procento s 20 nanogramy vstupní DNA a vyšší než bodové pět procent s 5 nanogramy . Chcete-li se o tom dozvědět více, podívejte se na naše video o testech cfDNA. Možná jste slyšeli o použití cfDNA pro analýzy na hranici detekce bodu nula jedna procenta. Ačkoli existuje technologie, která umožňuje dosáhnout 0,01 % (například digitální kapátko), je zde biologická hranice, o které musíme mluvit.
Z 10 ml vzorku krve pomocí soupravy Applied Biosystems MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit běžně získáme asi 20 nanogramů cfDNA, tedy asi 6 použitelných molekul pro analýzu. Rychlá matematika nám ukazuje, že při 1% limitu detekce můžeme očekávat přibližně 25 molekul. Při 0,1 % se očekává přítomnost pouze 2-3 molekul. To znamená, že pod 0,1 % nemusí být přítomny žádné molekuly pro analýzu. Nezapomeňte také, že koncentrace cfDNA jsou velmi proměnlivé. Mohou být velmi nízké v kritických fázích, jako je časná recidiva nebo rozvoj rezistence, na které se nyní zaměřuje mnoho výzkumníků. Pro úspěšnou izolaci 20 nanogramů DNA z krevní plazmy jsou k dispozici jak manuální, tak automatizované metody v závislosti na vašich potřebách propustnosti.
DNA v ruce, váš výzkum diktuje, jakou cestou se v tomto okamžiku vydat. Pro studie sledování recidivy můžete zvolit digitální PCR. Pro výzkum v oblasti výběru terapie může být upřednostněn test sekvenování nové generace. Ať už vás váš výzkum v oblasti tekuté biopsie zavede kamkoli, můžeme vám pomoci dostat se tam díky kompletním řešením pro analýzu cfDNA od několika cílů až po testy s více geny.
Doufám, že jsme vám poskytli několik věcí k zamyšlení, když zvažujete použití bezbuněčné DNA ve vaší laboratoři. Jsem si však jistý, že budete mít ještě nějaké otázky. Proto své dotazy pokládejte na webu thermofisher.com/ask a přihlaste se k odběru našeho kanálu, abyste viděli více podobných videí. A nezapomeňte, že když máte pochybnosti, prostě si to vyhledejte!