Metyltransferázy DNA (MTázy), které přenášejí metylovou skupinu z S-adenosylmethioninu na adeninové nebo cytosinové zbytky, se vyskytují u celé řady prokaryot a eukaryot. Při štěpení DNA restrikčními endonukleázami je třeba brát v úvahu metylaci, protože štěpení může být blokováno nebo narušeno, pokud je určitá báze v rozpoznávacím místě metylovaná.
Metylace u prokaryot
U prokaryot byly MTázy nejčastěji identifikovány jako prvky restrikčních/modifikačních systémů, které působí jako ochrana hostitelské DNA před štěpením příslušnou restrikční endonukleázou. Většina laboratorních kmenů E. coli obsahuje tři místně specifické DNA metylázy.
- Dam metyláza-metylace v poloze N6 adeninu v sekvenci GATC (1,2).
- Dcm metyltransferázy-metylace v poloze C5 druhého cytosinu v sekvencích CCAGG a CCTGG (1,3).
- EcoKI methylasa-methylace adeninu v sekvencích AAC(N6)GTGC a GCAC(N6)GTT.
Některá nebo všechna místa pro restrikční endonukleasu mohou být rezistentní vůči štěpení, pokud jsou izolovány z kmenů exprimujících Dam nebo Dcm methylasy, pokud se rozpoznávací místo methylasy překrývá s rozpoznávacím místem endonukleasy. Například plazmidová DNA izolovaná z Dam+ E. coli je zcela rezistentní vůči štěpení pomocí MboI, která štěpí místa GATC.
Ne všechna DNA izolovaná z E. coli je metylována ve stejné míře. Zatímco DNA pBR322 je plně modifikovaná (a je tedy zcela rezistentní vůči štěpení MboI), pouze asi 50 % míst λ DNA Dam je metylováno, pravděpodobně proto, že metyláza nemá možnost DNA plně metylovat před jejím zabalením do hlavy fága. Výsledkem je, že enzymy blokované modifikací Dam nebo Dcm poskytnou částečné vzory trávení s λ DNA.
Restrikční místa, která jsou blokována metylací Dam nebo Dcm, lze odmetylovat klonováním vaší DNA do dam-, dcm- kmene E. coli, například dam-/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925).
Restrikční místa lze také zablokovat, pokud je přítomno překrývající se místo. V tomto případě je část sekvence Dam nebo Dcm generována sekvencí restrikčního enzymu, po níž následuje doprovodná sekvence. Tuto situaci je také třeba vzít v úvahu při navrhování digesce restrikčních enzymů.
Eukaryotická metylace
CpG MTázy, které se vyskytují u vyšších eukaryot (např. Dnmt1), přenášejí metylovou skupinu na pozici C5 cytosinových zbytků. Vzory metylace CpG jsou dědičné, tkáňově specifické a korelují s genovou expresí. V důsledku toho se předpokládá, že metylace CpG hraje roli v diferenciaci a genové expresi (4).
Poznámka: Účinky metylace CpG jsou problémem především při štěpení eukaryotické genomové DNA. Vzorce metylace CpG se po naklonování DNA do bakteriálního hostitele nezachovávají.
Citlivost na metylaci
Níže uvedená tabulka shrnuje citlivost na metylaci pro restrikční enzymy NEB a uvádí, zda je štěpení blokováno nebo narušeno metylací Dam, Dcm nebo CpG, pokud nebo když se překrývá s jednotlivými rozpoznávacími místy. Tuto tabulku je třeba považovat spíše za vodítko pro chování uvedených enzymů než za absolutní ukazatel. Podrobnější informace a konkrétní příklady, na nichž jsou tyto pokyny založeny, naleznete v databázi restrikčních enzymů REBASE ,
- Marinus, M.G. a Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol. 114, 1143-1150. PMID: 4576399
- Geier, G.E.and Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem. 254, 1408-1413. PMID: 368070
- May, M.S. and Hattman, S.(1975) J. Bacteriol. 123, 768-770. PMID: 1097428
- Siegfried, Z. a Cedar, H. (1997) Curr. Biol. 7, r305-307. PMID: 9115385
Legenda
| ● | Není citlivý | ◆ | Slabý. |
| ◼ | Blokuje | ◇ ol | Zhoršeno překrytím |
| ◻ ol | Blokováno překrýváním | ◇ scol | Zhoršeno některými kombinacemi překrývání |
| ◻ scol | Blokováno některými kombinacemi překrývání | ||
Jednopísmenný kód