Abstrakt
Předchozí studie prokázaly, že přísun cholinu přímo souvisí s obezitou a inzulinovou rezistencí u myší vyvolanou dietou s vysokým obsahem tuků. Cílem této studie bylo zhodnotit, zda dodávka cholinu může také modulovat obezitu a inzulinovou rezistenci způsobenou genetickým defektem. Osmitýdenní samci myší ob/ob byli po dobu dvou měsíců krmeni buď dietou s nedostatkem cholinu, nebo dietou doplněnou cholinem. Hodnotila se hmotnost tkání včetně tukové a libové hmoty. Zkoumala se také nitrobuněčná signalizace, glukagon a inzulin v plazmě a glukózové a inzulinové toleranční testy. Dieta s nedostatkem cholinu zpomalila nárůst tělesné hmotnosti a snížila hmotnost tuku. Nedostatek cholinu také snížil hladinu glukózy v plazmě a zlepšil glukózovou a inzulinovou toleranci, ačkoli se zhoršilo ztučnění jater. Při dietě s nedostatkem cholinu byla rovněž pozorována zvýšená lipolytická aktivita tukové tkáně, snížení plazmatického glukagonu a snížená exprese jaterního glukagonového receptoru. Naše výsledky ukazují, že dieta s nedostatkem cholinu může snížit hmotnost tuku a zlepšit glukózovou toleranci u obézních a diabetických myší způsobenou genetickým defektem.
1. Úvod
Cholin je důležitý dietní faktor, který se podílí na některých zásadních procesech, jako je biosyntéza neurotransmiteru acetylcholinu a hlavní membránové složky fosfatidylcholinu (PC) . PC může být syntetizován buď cestou CDP-cholinu, nebo metylací fosfatidyletanolaminu fosfatidyletanolamin N-metyltransferázou (PEMT). Cesta PEMT je kvantitativně významná pouze v játrech . Cholin je také nezbytným prekurzorem neurotransmiteru acetylcholinu, který působí prostřednictvím muskarinových a nikotinových acetylcholinových receptorů. V posledních letech se ukazuje možná souvislost mezi cholinem a obezitou/diabetem . Byl navržen potenciál muskarinových acetylcholinových receptorů jako terapeutického cíle obezity . Nedávno jsme zjistili, že nedostatek PEMT může chránit myši před obezitou a inzulinovou rezistencí vyvolanou dietou s vysokým obsahem tuků . Tato ochrana však zmizela, když byla k dietě s vysokým obsahem tuků přidána vysoká dávka cholinu . Cesta PEMT následovaná katabolismem PC je jedinou známou biosyntetickou cestou pro cholin u savců . U myší s deficitem PEMT byl zjištěn významný pokles obsahu cholinu v několika tkáních (Li et al., nepublikované údaje), což poskytuje přímou souvislost mezi cholinem a obezitou/insulinovou rezistencí vyvolanou dietou s vysokým obsahem tuků. V této studii jsme myši ob/ob krmili dietou s nedostatkem cholinu (CD), abychom zhodnotili, zda nedostatek cholinu může také modulovat geneticky podmíněnou obezitu a inzulinovou rezistenci.
2. Materiál a metody
2.1. Zvířata a strava
Všechny postupy byly schváleny Institucionálním výborem pro péči o zvířata na University of Alberta v souladu s pokyny Kanadské rady pro péči o zvířata. Osmitýdenní samci myší ob/ob z laboratoře The Jackson Laboratory byli aklimatizováni po dobu 1 týdne. V každé skupině bylo použito 5 myší. Myši měly po dobu 2 měsíců volný přístup k dietě s nedostatkem cholinu (CD) nebo k dietě doplněné cholinem (CS). Dieta CD (MP Biomedicals Canada, katalogové číslo 901387) obsahovala 20 % tuku ve formě sádla. Dieta CS se skládala z diety CD, do které bylo přidáno 0,4 % (w/w) cholinchloridu. Myši byly usmrceny anestetizací isofluranem s následnou srdeční punkcí.
2.2. Myši byly usmrceny v anestezii isofluranem s následnou srdeční punkcí. Měření přírůstku tělesné hmotnosti, svalové hmoty a hmotnosti tuku
Tělesná hmotnost byla měřena každý týden. Pomocí systému EchoMRI byla analyzována libová hmotnost a hmotnost tuku, a to 2 měsíce po nasazení myší na dietu (premortem).
2.3. Glukózový a inzulínový toleranční test
Glukózový toleranční test: Po 12hodinovém lačnění dostaly myši intraperitoneální injekci (i.p.) 0,5 g dextrózy/kg tělesné hmotnosti rozpuštěné ve sterilizovaném fosfátovém pufru (PBS). Inzulinový toleranční test: po šestihodinovém půstu dostaly myši i.p. injekci 1,0 jednotky inzulinu (Sigma)/kg tělesné hmotnosti v PBS. Koncentrace glukózy v krvi byly měřeny glukometrem v ocasních krvácích před injekcí a v uvedených časech po ní.
2.4. Měření aktivity mitochondriálního komplexu I/II
Aktivita mitochondriálního komplexu I a II byla stanovena pomocí mitochondriálního proteinu. Stručně řečeno, pro izolaci mitochondriálního proteinu byly vzorky uchovávány na ledu a homogenizovány v pufru obsahujícím 75 mM sacharózu, 225 mM sorbitol, 1 mM EGTA a 0,1 % hovězího sérového albuminu bez obsahu mastných kyselin v 10mM Tris-HCl pH 7,4. Vzorky byly uchovávány na ledu a homogenizovány. Homogenát byl odstřeďován při 600× g po dobu 15 minut a vzniklý supernatant byl dále odstřeďován po dobu 20 minut při 16 200 otáčkách za minutu. Mitochondriální protein v peletách byl suspendován v pufru obsahujícím 20 mM Tris a 25 mM sacharózu (pH7,4) a uchováván při -80 °C až do použití. Měření aktivity se provádělo ve spektrofotometru po dobu 5 min jako pokles absorbance při 600 nm v důsledku redukce 2,6-dichlorfenol-indofenolu (DCPIP) na ubichinon-1 v přítomnosti buď NADH (substrát komplexu I), nebo odpovídajícím způsobem sukcinátu (substrát komplexu II). Reakce probíhala v přítomnosti antimycinu a kyanidu draselného jako inhibitoru komplexu III a komplexu IV. Rotenon, jako inhibitor komplexu I, byl rovněž zapojen do reakčního pufru pro aktivitu komplexu II.
2.5. Histologie a imunoblotting
Pro histologii byla játra nebo tukové polštářky vypreparovány do 10% formaldehydu v PBS, poté následovalo rutinní barvení hematoxylinem a eozinem. Pro imunoblotting byly po homogenizaci a odstředění vzorků jater při 600× g výsledné supernatanty podrobeny stanovení koncentrace proteinů (BioRad), aby bylo zajištěno, že stejné množství proteinů bylo vloženo do SDS-PAGE. Všechny primární protilátky proti hormonálně citlivé lipáze (fosfo-HSL/celkový HSL), fosfoenolpyruvátkarboxykináze (PEPCK), acetyl-CoA karboxyláze (fosfo-ACC/celkový ACC) a AMP-aktivované proteinkináze (fosfo-AMPK/celkový AMPK) byly zakoupeny od společnosti Cell Signaling. Protilátky proti izozymu 4 pyruvátdehydrogenázy (PDK4), glukagonovému receptoru byly získány od společnosti Abcam, ale supresor cytokinové signalizace 3 (SOCS3) a PGC-1α byly od společnosti Santa Cruz Biotechnology. tublin nebo aktin byly použity jako kontroly zatížení pro normalizaci. Obraz byl analyzován pomocí softwaru ImageJ.
2.6. Měření plazmatického inzulínu a glukagonu
Měření bylo provedeno pomocí soupravy pro stanovení glukagonu, inzulínu u myší/potkanů (Meso Scale Discovery) na základě pokynů společnosti.
2.7. Statistická analýza
Údaje jsou uvedeny jako průměr ± SD. Rozdíly byly hodnoceny pomocí studentova t-testu. Hodnota 𝑃<0,05 byla považována za signifikantní.
3. Výsledky
Dieta s nedostatkem cholinu významně zpomalila přírůstek tělesné hmotnosti do 2 měsíců (obr. 1(a)), aniž by ovlivnila spotřebu potravy (denní příjem potravy 7,21±1,23 g u myší CD oproti 7,39±1,31 g u myší CS, 𝑃>0,05). Mezi oběma skupinami byl významný rozdíl ve výchozí tělesné hmotnosti (30,42±1,70 g u myší CD versus 26,3±2,26 g u myší CS, 𝑃=0,01). Nedostatek cholinu neovlivnil hmotnost srdce, jater ani ledvin (obrázek 1b), ale došlo k významnému snížení hmotnosti nadvarlete a perirenálního tuku (obrázek 1c). Další analýza pomocí magnetické rezonance ukázala, že nedostatek cholinu snížil hmotnost celotělového tuku, ale zvýšil hmotnost libového tuku bez ohledu na to, zda je vyjádřena jako absolutní hmotnost nebo relativní procento k hmotnosti celého těla (obrázek 1 d)). Nedostatek cholinu zvýšil expresi fosfohormon-senzitivní lipázy tukové tkáně, aktivované formy enzymu (obrázek 1(e)). Na druhé straně nedostatek cholinu nezměnil morfologii tukové tkáně (obrázek 1(f)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Choline-deficientní dieta zmírňuje přírůstek tělesné hmotnosti a zvyšuje tukovou lipolytickou kapacitu. Osmitýdenní samci myší ob/ob měli po dobu 2 měsíců volný přístup k dietě CD nebo CS. Byl měřen přírůstek tělesné hmotnosti (a), hmotnost tkání (b), hmotnost epididymálního a perirenálního tuku (c) a hmotnost tuku a libové hmoty (d). Exprese proteinů fosfo- a celkové hormonálně citlivé lipázy v tukové tkáni byla stanovena pomocí imunoblotu (e). Řezy tukovými polštářky byly obarveny pomocí H & E (f). ∗∗𝑃<0,01 a ∗𝑃<0,05 ve srovnání se skupinou CS.
Kromě vlivu na tělesnou hmotnost snížil nedostatek cholinu také hladinu plazmatické glukózy nalačno (14,3±1,67 oproti 10,8±1,19, 𝑛=5, 𝑃<0,05) a glukagonu (obr. 2(a)), ačkoli neměl žádný vliv na hladinu plazmatického inzulínu (obr. 2(b)). U myší na dietě s nedostatkem cholinu bylo pozorováno významné zlepšení glukózové a inzulinové intolerance (obr. 2(c)-2(d)). Pro zkoumání základního mechanismu byly analyzovány klíčové enzymy pro oxidaci glukózy. Nedostatek cholinu snížil jaterní expresi proteinu PDK4 (obr. 3(a)), negativního regulátoru aktivity pyruvátdehydrogenázy, který řídí přítok mitochondriálního acetyl-CoA, což svědčí o zvýšené utilizaci glukózy. Podobně byly sníženy jaterní PGC-1α (známý předřazený modulátor PDK4) a PEPCK (následný cíl PGC-1 α a klíčový enzym pro glukoneogenezi) (obr. 3(b)), což naznačuje sníženou glukoneogenezi. Dále jsme zkoumali, zda zlepšení glukózové a inzulinové intolerance může souviset se změnou jaterního zánětu a mitochondriální funkce. Exprese proteinu SOCS3 (obr. 3c), markeru prozánětu, ani aktivita mitochondriální citrát syntázy nebyly ovlivněny (údaje nejsou uvedeny). Aktivita mitochondriálního komplexu II, ale nikoli komplexu I, však byla významně snížena nedostatkem cholinu (obrázek 3(d)). Zajímavé je, že proteinová exprese jaterního glukagonového receptoru byla nedostatkem cholinu rovněž snížena (obr. 3(e)).
(a)
(b)
(c)
(d)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
Choline-Deficitní dieta zlepšuje glukózovou a inzulinovou intoleranci. Osmitýdenní samci myší ob/ob měli po dobu 2 měsíců volný přístup k dietě CD nebo CS. Byla měřena hladina plazmatického glukagonu (a) a inzulinu (b) nalačno. Byl proveden intraperitoneální glukózový toleranční test (c) a inzulinový toleranční test (d). ∗∗𝑃<0,01 a ∗𝑃<0,05 ve srovnání se skupinou CS.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Molekulární mechanismy podílející se na zlepšení citlivosti na inzulín u myší ob/ob na cholinu.deficientní dietě. Osmitýdenní samci myší ob/ob měli po dobu 2 měsíců volný přístup k dietě CD nebo CS. Jaterní exprese proteinů PDK4 (a), PEPCK, PGC-1α (b), SOCS3 (c) a glukagonového receptoru (e) byla stanovena pomocí imunoblotu. Byla rovněž měřena aktivita mitochondriálního komplexu I a II (d). ∗𝑃<0,05 ve srovnání se skupinou CS.
Ačkoli nedostatek cholinu zlepšuje glukózovou toleranci, zhoršuje ztučnění jater, což je podpořeno histologickou analýzou a zvýšenou hmotností jaterních triglyceridů (obr. 4 a)). Abychom pochopili mechanismy, které jsou základem ztučnění jater vyvolaného nedostatkem cholinu, zabývali jsme se enzymy zapojenými do β-oxidace mastných kyselin a lipogeneze. Nedostatek cholinu zvýšil aktivitu jaterní glycerol-3-fosfo-acyltransferázy (GPAT) (obr. 4b) a snížil aktivitu β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenázy (β-HAD) (obr. 4c), klíčového enzymu β-oxidace mastných kyselin, což naznačuje, že více intracelulárních mastných kyselin bylo nasměrováno do biosyntézy lipidů než do oxidace. Tato představa byla dále podpořena snížením exprese fosfo-AMPK a fosfo-ACC v játrech (obrázek 4(d)), což pak aktivuje ACC a zvyšuje jaterní lipogenezi.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Molekulární mechanismy podílející se na vzniku ztukovatělých jater u ob/ob myší na cholinu.deficientní dietě. Osmitýdenní samci myší ob/ob měli po dobu 2 měsíců volný přístup k dietě CD nebo CS. Řezy jater byly obarveny protokolem barvení H & E a bylo změřeno množství jaterních triglyceridů (a). Byla zjišťována aktivita glycerol-3-fosfát-acyltransferázy (GPAT) (b) a β-hydroxyl acyl-CoA dehydrogenázy (β-HAD) (c). Byla sledována exprese proteinů fosfo-AMPK a fosfo-ACC (d). ∗𝑃<0,05 ve srovnání se skupinou CS.
4. Diskuse
V předchozí práci jsme prokázali, že suplementace cholinem je spojena s obezitou a inzulinovou rezistencí vyvolanou dietou s vysokým obsahem tuků u myší s deficitem PEMT . Nedávno jsme zjistili, že inzulinová rezistence vyvolaná cholinem je specifická nejen u myší divokého typu, ale také u myší s deficitem PEMT (Wu a Vance et al. nepublikované údaje). V současné studii jsme zkoumali vliv deprivace cholinu na myši ob/ob. Prokázali jsme pět nových účinků nedostatku cholinu: (1) zvýšenou tukovou lipolytickou aktivitu; (2) zlepšenou oxidaci glukózy; (3) sníženou oxidaci jaterních mastných kyselin; (4) sníženou expresi jaterních glukagonových receptorů; (5) sníženou aktivitu jaterního mitochondriálního komplexu II.
4.1. Nedostatek cholinu zmírňuje přírůstek tělesné hmotnosti
Deficit cholinu významně zmírňuje obezitu vyvolanou dietou s vysokým obsahem tuků u myší Pemt-/- a přírůstek tělesné hmotnosti u myší ob/ob. Raubenheimer a kol. však uvádějí, že nedostatek cholinu neovlivňuje přírůstek hmotnosti ani hmotnost tukové tkáně . Rozdíl mezi oběma studiemi může být způsoben rozdíly ve zvířecích modelech a protokolech krmení. V Raubenheimerově studii byly myši C57Bl/6 krmeny buď vysokotučnou, nebo nízkotučnou dietou po dobu 8 týdnů, ale myši dostávaly CD nebo CS dietu pouze poslední 4 týdny. Naše myši ob/ob byly 8 týdnů krmeny dietou CD nebo CS s vysokým obsahem tuku. V literatuře se v metabolických studiích, jako je přírůstek tělesné hmotnosti a citlivost jater (a svalů) na inzulín, hojně používají samci i samice myší ob/ob a nebyl zaznamenán žádný významný vliv pohlaví. V naší studii byli použiti pouze samci myší ob/ob.
Naše současná studie ukazuje, že cholin může také modulovat geneticky podmíněnou obezitu. Vzhledem k tomu, že nedostatek cholinu neovlivnil konzumaci potravy, může zvýšená lipolytická aktivita tukové tkáně (zvýšená exprese aktivní hormonálně citlivé lipázy) vysvětlovat snížení tukové hmoty a přírůstek tělesné hmotnosti. Kromě toho nemůžeme vyloučit, že nedostatek cholinu může zvýšit energetický výdej nebo expresi UCP1 v hnědé tukové tkáni a UCP2/UCP3 v kosterním svalstvu, což jsou potenciální faktory přispívající ke snížení přírůstku tělesné hmotnosti .
4.2. Nedostatek cholinu zlepšuje glukózovou toleranci
Na rozdíl od suplementace cholinem, která je u myší spojena s inzulinovou rezistencí vyvolanou dietou s vysokým obsahem tuků , nedostatek cholinu zlepšil glukózovou toleranci u ob/ob myší. To je v souladu s Raubenheimerovou studií, kde myši C57Bl/6 na CD dietě s vysokým obsahem tuků měly sníženou hladinu inzulínu a zlepšenou glukózovou toleranci ve srovnání se suplementací cholinu dietou s vysokým obsahem tuků . Vysoká hladina glukagonu v plazmě se obvykle vyskytuje u pacientů s diabetem 2. typu . Injekce cholinu zvýšila u potkanů plazmatickou hladinu inzulinu i glukagonu . Naopak nedostatek cholinu v naší studii snížil plazmatický glukagon a snížil expresi glukagonového receptoru . Vzhledem k tomu, že v posledních letech jsou antagonisté glukagonového receptoru navrhováni jako potenciální léčiva diabetu 2. typu , tak snížená proteinová exprese glukagonového receptoru u ob/ob myší na dietě s nedostatkem cholinu může do jisté míry vysvětlovat zlepšenou glukózovou toleranci. Snížená exprese PGC-1α v játrech probíhala současně se snížením regulace PEPCK a PDK4, což svědčí o sníženém výdeji glukózy a zvýšené oxidaci glukózy. Snížená regulace aktivity β-HADH naznačovala sníženou oxidaci mastných kyselin. Tyto procesy byly doprovázeny sníženou aktivitou mitochondriálního komplexu II, což může odrážet kompenzační odpověď na snížený mitochondriální oxidační stres. Zlepšení glukózové tolerance vlivem CD bylo tedy způsobeno sníženým jaterním výdejem glukózy a zvýšenou utilizací glukózy. K tomu mohlo dojít potlačením jaterního glukagonového receptoru, který reguluje AMPK prostřednictvím adenylátcyklázy, čímž moduluje PGC-1α a jeho následné cíle, jako jsou PEPCK a PDK4, a také kapacitu jaterního mitochondriálního elektronového transportu. Je tedy zapotřebí dalšího výzkumu, aby se prokázalo, zda by glukagonový receptor mohl být novým terapeutickým cílem pro diabetes.
4.3. Nesouvislost mezi ztučnělými játry a inzulinovou rezistencí
Bylo prokázáno, že ztučnělá játra jsou prediktorem diabetu 2. typu nezávislým na obezitě. Předpokládá se, že zvýšené množství intracelulárních mastných kyselin hraje příčinnou roli v jaterní inzulínové rezistenci . V současné studii nedostatek cholinu zhoršoval ztučnění jater, u kterých bylo pozorováno snížení aktivity β-hydroxyacyl CoA dehydrogenázy a zvýšení aktivity glycerol palmitoyl-acyl transferázy, což naznačuje roli cholinu v modulaci metabolismu mastných kyselin. Přesměrování mastných kyselin do jaterních zásob triglyceridů tedy může být počátečním ochranným mechanismem ke snížení jaterních intracelulárních koncentrací mastných kyselin. Dlouhodobý nedostatek cholinu je však spojen s hepatosteatózou, rizikem defektu neurální trubice, stejně jako rizikem rakoviny a ztrátou paměti , což může omezit použití diety s nedostatkem cholinu jako dlouhodobé terapeutické strategie při obezitě a inzulínové rezistenci.
Závěrem lze říci, že nedostatek cholinu může zabránit nárůstu tělesné hmotnosti a zlepšit glukózovou toleranci u ob/ob myší. Mírné omezení příjmu potravin s vysokým obsahem cholinu může prospět pacientům s obezitou, prediabetem a diabetem. Naše výsledky naznačují nové možné terapeutické přístupy.
Zkratky
| PC: | Fosfatidylcholin |
| PEMT: | Fosfatidylethanolamin N-methyltransferáza |
| CD: | Cholin deficientní |
| CS: | Choline supplement |
| HSL: | Hormone sensitive lipase |
| PEPCK: | Fosfoenolpyruvátkarboxykináza |
| ACC: | Acetyl-CoA karboxyláza |
| AMPK: | AMP-aktivovaná proteinkináza (AMPK) |
| PDK4: | Pyruvátdehydrogenáza kináza izozym 4 |
| SOCS3: | Supresor cytokinové signalizace 3 |
| GPAT: | Glycerol-3-fosfo-acyltransferáza. |
Příspěvek autorů
G. Wu a L. Zhang přispěli rovným dílem.
Zveřejnění informací o autorech
Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.
Poděkování
Tato práce byla podpořena grantem (MOP 89793) od Canadian Institutes of Health Research.