Dideoxynukleotid

Inhibice nukleofilního útoku v důsledku nepřítomnosti 3′-OH skupiny

Sangerova metoda se používá k amplifikaci cílového úseku DNA, aby bylo možné přesně určit sekvenci DNA. Začlenění ddNTP do reakčních ventilů se jednoduše používá k ukončení syntézy rostoucího vlákna DNA, což vede k částečně replikovaným fragmentům DNA. Je to proto, že DNA polymeráza vyžaduje k vytvoření fosfodiesterové vazby 3′ OH skupinu rostoucího řetězce a 5′ fosfátovou skupinu vstupujícího dNTP. Někdy polymeráza DNA začlení ddNTP a nepřítomnost 3′ OH skupiny přeruší kondenzační reakci mezi 5′ fosfátem (po odštěpení pyrofosfátu) přicházejícího nukleotidu s 3′ hydroxylovou skupinou předchozího nukleotidu na rostoucím řetězci. K této kondenzační reakci by normálně došlo při inkorporaci nemodifikovaného dNTP polymerázou DNA. Zjednodušeně řečeno, nukleofilní útok 3′ OH skupiny vede k přidání nukleotidu na rostoucí řetězec. Nepřítomnost 3′ hydroxylové skupiny brání tomuto nukleofilnímu útoku a znemožňuje DNA polymeráze pokračovat v její funkci.

Tento objev vedl k vhodnému názvu „řetěz ukončující nukleotidy“. Dedeoxyribonukleotidy nemají 3′ hydroxylovou skupinu, a proto nemůže dojít k dalšímu prodlužování řetězce, jakmile je tento dideoxynukleotid na řetězci. To může vést k ukončení sekvence DNA. Tyto molekuly tak tvoří základ metody dideoxynukleotidového ukončení řetězce při sekvenování DNA, o které informoval Frederick Sanger a jeho tým v roce 1977 jako o rozšíření dřívější práce. Sangerův přístup byl v roce 2001 popsán jako jedna ze dvou základních metod sekvenování fragmentů DNA (druhou je Maxamova-Gilbertova metoda), ale Sangerova metoda je zároveň „nejrozšířenější metodou a metodou používanou většinou automatických sekvenátorů DNA“. Sanger získal svou druhou Nobelovu cenu za chemii v roce 1980 a dělil se o ni s Walterem Gilbertem („za jejich příspěvky týkající se určování sekvencí bází v nukleových kyselinách“) a s Paulem Bergem („za základní studie biochemie nukleových kyselin se zvláštním zřetelem k rekombinantní DNA“) a o použití dideoxynukleotidů hovořil ve své nobelovské přednášce.

Sekvenování DNAEdit

Dideoxynukleotidy jsou užitečné při sekvenování DNA v kombinaci s elektroforézou. Vzorek DNA, který projde PCR (polymerázovou řetězovou reakcí) ve směsi obsahující všechny čtyři deoxynukleotidy a jeden dideoxynukleotid, vytvoří vlákna o délce odpovídající poloze každé báze typu, který doplňuje typ s přítomným dideoxynukleotidem. Taq polymeráza používaná při PCR upřednostňuje ddGNTP, což byl vzorec pozorovaný při různých výzkumech. To znamená, že každá nukleotidová báze daného typu má pravděpodobnost, že se nenaváže na deoxynukleotid, ale na dideoxynukleotid, který ukončuje prodlužování řetězce. Pokud se tedy vzorek následně podrobí elektroforéze, bude přítomen pás pro každou délku, v níž je přítomen komplement dideoxynukleotidu. V současné době je běžné používat fluorescenční dideoxynukleotidy, takže každý ze čtyř má jinou fluorescenci, kterou lze detekovat sekvenátorem; je tedy zapotřebí pouze jedna reakce.

.

Napsat komentář