Není zvýšená regulace CAP1, ale zvýšená fosforylace S308/S310, byla zjištěna v buňkách karcinomu pankreatu
Hladiny proteinu CAP1 byly stanoveny metodou Western blotting v panelu běžně používaných buněčných linií karcinomu pankreatu {PANC-126, CFPAC-127, AsPC-128 a Mia PaCa-229} a porovnány s hladinou v imortalizované, ale netransformované buněčné linii pankreatu hTERT-HPNE30, která slouží jako kontrola. Jak ukazuje obr. 1A, všechny čtyři nádorové buněčné linie exprimují hojné množství CAP1, které je srovnatelné s množstvím v buňkách HeLa, u nichž jsme dříve uvedli, že exprimují hojné množství CAP1 i CAP212. Zjistili jsme, že netransformované buňky hTERT-HPNE exprimují srovnatelné hladiny CAP1 jako nádorové buněčné linie. Zkoumali jsme také hladiny exprese druhé izoformy CAP, CAP2, a zjistili jsme, že buňky PANC-1 a Mia PaCa-2 mají výrazně zvýšenou expresi CAP2 ve srovnání s buňkami hTERT-HPNE (obr. 1A).
V buňkách karcinomu pankreatu byla zjištěna zvýšená fosforylace S308/S310 na CAP1, nikoli však zvýšená exprese CAP1. (A) Western blot ukazuje, že ve všech čtyřech nádorových buněčných liniích byly zjištěny hojné hladiny exprese CAP1 srovnatelné s expresí v buňkách HeLa a kontrolní buňky pankreatu (hTERT-HPNE) mají podobnou hladinu exprese CAP1. Výsledky blotu CAP2 ukazují, že rakovinné buňky PANC-1 a Mia PaCa-2 exprimují hojné hladiny CAP2, které byly pozoruhodně vyšší než u kontrolních buněk hTERT-HPNE. (B) Western blot odhaluje zvýšenou fosforylaci S308/S310 na CAP1 v rakovinných buňkách pankreatu PANC-1 a CFPAC-1 ve srovnání s buňkami netransformovaného pankreatu hTERT-HPNE. Fosforově specifická protilátka rozpoznává fosforové signály na obou zbytcích. Zarovnané sekvence nahoře ukazují sekvence, které obklopují tandemové fosforové regulační místo. Serinové zbytky (S307 & S309 u myšího CAP1; S308 & S310 u lidského CAP1) v tandemovém místě jsou zvýrazněny tučně a kurzívou (také podtrženy). Fosforové signály byly kvantifikovány pomocí denzitometrie a výsledky ze tří experimentů byly analyzovány Studentovým t-testem a vyneseny do grafu, kde chybové sloupce představují S.E.M. „*“ označuje P < 0,05 a „**“ označuje P < 0,01. (C) Ošetření buněk inhibitorem GSK3 6-BIO po dobu 16 hodin pozoruhodně snížilo fosforylaci CAP1 jak u buněk karcinomu pankreatu PANC-1, tak u buněk hTERT-HPNE, a to v závislosti na dávce. 6-BIO také podobně snížil fosforylaci CAP1 v buňkách CFPAC-1 (není uvedeno). GAPDH slouží jako kontrola zatížení při Western blotu.
Dříve jsme uvedli, že GSK3 fosforyluje S309 na myším CAP124 (odpovídá S310 na lidském CAP1; zarovnané sekvence jsou uvedeny na obr. 1B). Vzhledem k hlášené hyperaktivaci GSK3 u karcinomu pankreatu25 jsme se zabývali možným zvýšením fosforylace S308/S310 na CAP1 v nádorových buňkách pomocí protilátky specifické pro fosfor, která při Western blottingu rozpoznává fosforylační signály na obou serinových zbytcích24. Je zajímavé, že fosforylace S308/310 byla v nádorových buňkách významně zvýšená ve srovnání s fosforylací v kontrolních buňkách (obr. 1B, znázorněno kvantifikovanými údaji pouze pro buněčné linie PANC-1 a CFPAC-1, ale podobné výsledky byly získány i u buněk AsPC-1 a Mia PaCa-2). Dále jsme inhibovali GSK3 ošetřením nádorových buněk silným inhibitorem GSK3 6-BIO (6-bromoindirubin-3′-oxim)31 a zjistili jsme, že ošetření snížilo fosforylaci S308/S310 na CAP1 v buňkách PANC-1 a CFPAC-1 v závislosti na dávce (obr. 1C, zobrazeno pouze pro buňky PANC-1). Léčba přípravkem 6-BIO rovněž snížila fosforylaci CAP1 v kontrolních buňkách pankreatu. V souladu s tím selektivnější inhibitor GSK3, LiCl32, rovněž snížil fosforylaci CAP1 v buňkách PANC-1 a AsPC-1, jak je uvedeno později. Tyto výsledky potvrzují, že GSK3 je také součástí mechanismu fosforylace CAP1 na S308/S310 v buňkách karcinomu pankreatu. Je také třeba poznamenat, že léčba nádorových buněk a kontrolních buněk přípravkem 6-BIO důsledně vedla ke znatelné up-regulaci CAP1, a to neznámým mechanismem.
Vyřazení CAP1 vedlo k zesílení stresových vláken a také ke snížení pohyblivosti a invaze nádorových buněk
Dalším pokusem bylo umlčení CAP1, abychom určili roli CAP1 v buňkách rakoviny slinivky břišní. Paradigma stabilního knockdownu, které jsme dříve vyvinuli, je kompatibilní se záchrannou strategií, která umožňuje ověřit specifičnost odvozených fenotypů z deplece CAP112,18,24 . Pomocí dvou konstruktů shRNA S2 a S3, které cílí na nezávislé nukleotidové sekvence a účinně umlčují CAP1 v buňkách karcinomu HeLa a prsu12,18,24,33, se nám podařilo vytvořit stabilní klony s účinným knockdownem CAP1 v buňkách PANC-1 a AsPC-1, jak bylo potvrzeno při Western blotu (obr. 2A). Neomycinovou selekcí byly vytvořeny vždy dva stabilní klony s knockdownem odvozené z PANC-1 (S2-1 a S3-3) a AsPC-1 (S2-3 a S2-7). Pokusy o umlčení CAP1 v nádorových buněčných liniích CFPAC-1 a Mia PaCa-2 však byly neúspěšné. Buňky CFPAC-1 po selekci antibiotiky nevytvořily kolonie, zatímco u žádné z přibližně dvou desítek stabilních kolonií, které byly prověřeny, nedošlo k podstatnému snížení exprese CAP1 v buňkách Mia PaCa-2 (údaje nejsou uvedeny).
Vyřazení CAP1 v nádorových buňkách vedlo k zesílení aktinových stresových vláken a ke snížení pohyblivosti a invaze buněk. (A) Účinné vyřazení CAP1 u dvou stabilních klonů, každý pro buňky PANC-1 a AsPC-1, jak bylo potvrzeno při Western blotu. CAP1 byl detekován ve Western blotu, kde byl jako kontrola zatížení použit GAPDH. (B) Deplece CAP1 v buňkách PANC-1 vedla k zesílení aktinových stresových vláken. V kontrolních buňkách, které nesly prázdný vektor pro shRNA (Vec), byla aktinová stresová vlákna (označená šipkami) velmi omezená. Naproti tomu v buňkách s knockdownem CAP1 (S2-1 a S3-3) byla aktinová stresová vlákna zesílená (označeno šipkami), jak bylo pozorováno při fluorescenční mikroskopii po barvení falloidinem. (C) Deplece CAP1 snížila pohyblivost buněk PANC-1 i AsPC-1, jak bylo zjištěno v testech hojení ran a Transwellově migračním testu (pouze u PANC-1). Pro Transwellovy migrační testy bylo na každou destičku umístěnou v jamce s médiem obsahujícím sérum vloženo ~2 × 104 buněk, které byly přes noc zbaveny séra. Po 16 hodinách byly hodnoceny migrující buňky a byly shromážděny údaje ze tří nezávislých experimentů, analyzovány pomocí Studentova t-testu a vyneseny do grafu, kde chybové sloupce představují S.E.M. „*“ označuje P < 0,05 ve srovnání s kontrolními buňkami nesoucími prázdný vektor (Vec). (D) Deplece CAP1 snižuje invazi do Matrigelu u buněk PANC-1. Testy, sběr dat a analýzy byly provedeny podobně jako v případě migračních testů Transwell s tím rozdílem, že vložené membrány byly předem potaženy materiálem Matrigel. „*“ označuje P < 0,05 ve srovnání s kontrolními buňkami. (E) Snížená EMT u buněk PANC-1 s knockdownem CAP1, jak ukazuje zvýšená exprese E-Cadherinu i snížená hladina exprese Vimentinu u stabilních klonů s knockdownem CAP1. GAPDH slouží jako kontrola zatížení ve Western blotech.
Nejprve jsme zkoumali morfologické změny a změny aktinového cytoskeletu u buněk PANC-1 a AsPC-1 s knockdownem CAP1. Na rozdíl od zvětšené velikosti buněk u buněk HeLa a metastatického karcinomu prsu s knockdownem CAP112,18,24 nezpůsobila deplece CAP1 znatelné zvětšení velikosti buněk PANC-1 nebo AsPC-1. V případě buněk PANC-1 a AsPC-1 jsme zjistili, že se jejich velikost zvětšila. Dále jsme obarvili aktinový cytoskelet v buňkách PANC-1 falloidinem a následně provedli fluorescenční mikroskopii. Zdá se, že buňky PANC-1 (a buňky karcinomu pankreatu obecně) mají oproti buněčným liniím běžně používaným pro studium aktinového cytoskeletu, jako jsou HeLa a NIH3T3 fibroblasty12,24 , špatně organizované struktury aktinového cytoskeletu, zejména pokud jde o stresová vlákna (obr. 2B). Nicméně v buňkách PANC-1 s knockdownem CAP1 bylo ve srovnání s kontrolními buňkami patrné zvýšené množství stresových vláken (obr. 2B). Všech 26 zkoumaných kontrolních buněk, které nesly prázdný vektor, vykazovalo velmi omezenou přítomnost stresových vláken. Naproti tomu 20 z 27 (74,1 %) zkoumaných buněk S2-1 a 18 z 23 (78,3 %) zkoumaných buněk S3-3 s knockdownem CAP1 mělo pozoruhodně rozšířená stresová vlákna, podobně jako na obr. 2B. Hromadění stresových vláken bylo soustavně pozorováno i u jiných buněk s deplecí CAP112,13, což je fenotyp, který pravděpodobně vznikl ztrátou obou funkcí CAP1 při sekvestraci aktinových monomerů a při podpoře obratu aktinových vláken.
V souladu se zvýšeným výskytem stresových vláken bylo zjištěno, že deplece CAP1 snižuje pohyblivost u řady typů savčích buněk, včetně nádorových buněk13,14,17,18,19. Bylo také zjištěno, že přechodné vyřazení CAP1 u buněk rakoviny slinivky břišní snižuje pohyblivost buněk v testech hojení ran14. Testovali jsme vliv stabilního vyřazení CAP1 na invazivitu buněk karcinomu pankreatu pomocí testů hojení ran, Transwellových migračních testů a Matrigelových invazivních testů. Deplece CAP1 podstatně snížila pohyblivost buněk v testech hojení ran u buněk PANC-1 i AsPC-1 (obr. 2C), což je v souladu s dříve uvedenými výsledky14. Rány u buněk PANC-1 s knockdownem CAP1 (S3-3 i S2-1) se po 24 hodinách od zavedení hojily pouze okrajově, zatímco u kontrolních buněk se mezera téměř zcela vyplnila. Podobný efekt byl pozorován i u stabilních klonů AsPC-1 S2-3 a S2-7 s knockdownem CAP1 (obr. 2C). Výsledky z Transwellových migračních testů buněk PANC-1 odpovídaly výsledkům z testů hojení ran, jak ukazuje graf kvantifikovaných výsledků na spodním panelu (obr. 2C). Invazivní testy navíc odhalily, že deplece CAP1 rovněž snížila schopnost nádorových buněk PANC-1 pronikat a invadovat přes Matrigel (obr. 2D). Studentovy t-testové analýzy dat získaných ze tří nezávislých testů odhalují významně sníženou invazi u stabilních buněk PANC-1 s knockdownem CAP1 (obr. 2D). A konečně, protože EMT (epiteliálně-mezenchymální přechod) souvisí s invazivitou nádorových buněk, testovali jsme potenciální vliv knockdownu CAP1 na EMT. U buněk PANC-1 s vyřazeným CAP1 se skutečně zvýšila regulace E-Cadherinu, což svědčí o snížené EMT (obr. 2E). Testovali jsme také další marker EMT, vimentin, a zjistili jsme, že deplece CAP1 snižuje jeho expresi (obr. 2E). Tyto výsledky společně podporují potřebnou roli CAP1 v invazivitě a EMT u nádorových buněk PANC-1.
Inhibice GSK3, která potlačuje fosforylaci CAP1, snížila pohyblivost a invazi nádorových buněk
Naše předchozí zjištění naznačují, že přechodná fosforylace je klíčová pro funkci CAP1 při regulaci aktinového cytoskeletu24. Zvýšená fosforylace CAP1 v buňkách rakoviny slinivky břišní, která je v souladu s aktivovaným GSK3, naznačuje, že regulace fosforu může hrát roli i pro funkci CAP1 při invazivitě nádorových buněk. Tuto možnost jsme testovali inhibicí GSK3, která potlačuje fosforylaci S308/S310 a mezitím narušuje regulaci CAP1 přechodnou fosforylací v regulačním místě. Buňky PANC-1 byly ošetřeny přípravkem 6-BIO a následně byly provedeny testy migrace a invaze buněk. Nejprve byly testovány účinky snížené fosforylace S308/S310 na CAP1 při léčbě 5 μM 6-BIO (obr. 1C). Jak ukazuje obr. 3A, léčba přípravkem 6-BIO významně snížila pohyblivost buněk PANC-1 jak v testu hojení ran, tak v Transwellově migračním testu. Potvrdili jsme také, že ošetření buněk PANC-1 a AsPC-1 dalším inhibitorem GSK3, LiCl, snížilo fosforylaci CAP1 i pohyblivost buněk v testech hojení ran (obr. 3A,B). Kromě toho léčba 6-BIO také snížila invazi buněk PANC-1 do Matrigelu (obr. 3C). A konečně, jelikož je známo, že GSK3 reguluje širokou škálu buněčných funkcí prostřednictvím množství substrátových molekul, je pravděpodobné, že účinek inhibice GSK3 na buněčnou motilitu je kolektivním výstupem prostřednictvím více cílů GSK3, které se podílejí na regulaci cytoskeletu, polarizaci buněk a migraci34,35. Testovali jsme tedy a porovnávali účinky 6-BIO na snížení buněčné motility u buněk PANC-1 s vyřazeným CAP1 a u kontrolních buněk. Jak ukazuje graf na obr. 3D, léčba 6-BIO významně snížila motilitu kontrolních buněk (Vec), ale nikoliv motilitu CAP1-knockdown buněk (S2-1 a S3-3) v testech hojení ran. Celkově tyto výsledky potvrzují, že regulace fosforu prostřednictvím S308/S310 hraje důležitou roli pro CAP1 při podpoře pohyblivosti a invaze v buňkách karcinomu pankreatu.
Inhibice GSK3, která snížila fosforylaci CAP1, rovněž narušila pohyblivost a invazi nádorových buněk. (A) Ošetření buněk PANC-1 přípravkem 6-BIO nebo LiCl snížilo pohyblivost buněk v testech hojení ran a migrace Transwell. Léčba 100 mM LiCl rovněž účinně snížila fosforylaci CAP1 v buňkách PANC-1. Transwellovy migrační testy s buňkami PANC-1 byly provedeny podobně, jak je popsáno na obr. 2, kde NT označuje buňky bez ošetření 6-BIO. (B) Ošetření 100 mM LiCl rovněž znatelně snížilo fosforylaci CAP1 v buňkách AsPC-1 a také pohyblivost buněk v testech hojení ran. (C) Ošetření buněk PANC-1 5 μM 6-BIO významně snížilo invazi nádorových buněk v invazivních testech na Matrigelu. Matrigelové invazivní testy, včetně sběru a analýzy dat, byly provedeny podobně, jak je popsáno na obr. 2D. (D) Knockdown CAP1 v buňkách PANC-1 zhoršil účinek 6-BIO na snížení pohyblivosti buněk v testech hojení ran. Kontrolní a stabilní klony PANC-1 s knockdownem CAP1 byly kultivovány 16 hodin po zavedení rány a čárkované čáry označují okraje počáteční mezery. Buněčná motilita byla kvantifikována, analyzována pomocí Studentova t-testu a vynesena do grafu, kde chybové sloupce představují směrodatnou odchylku. „*“ označuje P < 0,05 a „**“ označuje P < 0,01.
Fosforové mutanty CAP1 měly zhoršenou funkci při zmírňování zvýšeného napětí vláken a podpoře vývoje lamellipodií v buňkách PANC-1 s vyřazeným CAP1
Naše zjištění z buněk s vyřazeným CAP1 podporují, že CAP1 je nutný pro motilitu a invazi nádorových buněk, a výsledky inhibice GSK3 naznačují, že fosforylace S308/S310 hraje klíčovou roli ve funkci CAP1. Dále jsme použili strategii opětovného vyjádření, abychom tyto případy dále prokázali. Divoký typ CAP1 (WTCAP1) a fosforové mutanty, které napodobují buď fosforylované (S307D/S309D; DD), nebo nefosforylované (S307A/S309A; AA) formy CAP1, jak bylo popsáno dříve12,18,24, byly stabilně reexprimovány v buňkách PANC-1 s vyřazeným CAP1, aby se otestovala jejich schopnost zachránit aktinový cytoskelet a morfologické fenotypy buněk. Tyto mutanty obsahují neshody s cílovou sekvencí shRNA S3, aby se zabránilo rozpoznání odvozených mRNA shRNA stabilně přítomnou v knockdown buňkách, ale bez změny jakékoliv aminokyseliny na CAP112. Podařilo se nám vytvořit stabilní klony, které znovu exprimují WT myší CAP1 nebo fosforové mutanty AA a DD, jak bylo potvrzeno při Western blotu proti značce 6xHis (obr. 4A). Všimněte si, že z původního snímku Western blotu byly odstraněny dvě irelevantní dráhy (vzorky v těchto dvou drahách byly použity k potvrzení reexprese dvou fosforových mutant se serinem 36 na N-konci). Celý soubor původního výsledku Western blotu je uveden na doplňkovém obr. 1. Morfologie buněk reexprimujících mutant AA (AA-R) nebo DD (DD-R) byla zkoumána ve fázovém mikroskopu a porovnána s morfologií buněk reexprimujících WTCAP1 (WT-R). Bylo zjištěno, že knockdown CAP1 u některých typů savčích buněk, včetně buněk HeLa a metastatického karcinomu prsu, vedl k významnému zvětšení velikosti buněk12,13,18, což je fenotyp, u kterého jsme dříve potvrdili, že je specifický pro knockdown CAP112,18 . Vyřazení CAP1 u buněk PANC-1 nebo AsPC-1 však tento účinek nevykazovalo. Naopak, stabilní reexprese WTCAP1 nebo fosforových mutantů v buňkách s knockdownem ve skutečnosti významně zvětšila velikost buněk (obr. 4B). Navíc opětovná exprese WTCAP1 vedla ke vzniku lamellipodií robustní velikosti (označených šipkami), což je subcelulární struktura bohatá na vláknitý aktin, která je rozhodující pro řízení směrového pohybu buněk (obr. 4C), zatímco prakticky u žádné z knockdownovaných buněk s prázdným kontrolním vektorem se žádná taková lamellipodie nevytvořila. Reexprese mutantů AA nebo DD také do určité míry stimulovala tvorbu lamellipodií, ale jejich velikost byla ve srovnání s buňkami reexprimujícími WTCAP1 znatelně menší (na obr. 4C označeno šipkami). U každého typu buněk jsme spočítali 200 buněk a procento buněk, které ukrývají lamellipodie velké velikosti, bylo následující: 0 % (0/200) pro buňky s knockdownem (Vec), 14,5 % (29/200) pro buňky WT-R a 9 % (18/200), respektive 7,5 % (15/200) pro buňky AA-R a DD-R.
Vliv reexprese WTCAP1 a fosforových mutantů v CAP1-knockdown buňkách PANC-1 na aktinový cytoskelet, velikost buněk a vývoj lamellipodií. (A) Potvrzení reexprese WTCAP1 a fosforových mutantů AA a DD ve stabilních buňkách S3-3 CAP1-knockdown PANC-1 ve Western blotu pomocí protilátky proti značce 6xHis. Z původního snímku Western blotu byly odstraněny dvě irelevantní dráhy (uvedeno na doplňkovém obr. 1); (B) kvantifikované údaje ukazující významně zvětšenou velikost buněk u buněk reexprimujících WTCAP1 nebo fosforové mutanty v buňkách s knockdownem CAP1. Velikosti 50 buněk v jednom poli byly měřeny pomocí programu Image-J. Data byla analyzována pomocí Studentova t-testu a vynesena do grafu, kde chybové úsečky označují směrodatnou odchylku. „*“ označuje P < 0,05 ve srovnání s kontrolními buňkami nesoucími prázdný vektor (Vec-R). (C) Fázové snímky ukazují, že reexprese WTCAP1 nebo fosforových mutantů stimulovala tvorbu lamellipodií. Některé z buněk reexprimujících WTCAP1 (WT-R) vytvořily extrémně velké lamellipodie (označené šipkami). Reexprese mutantů AA (AA-R) nebo DD (DD-R) rovněž simulovala tvorbu lamellipodií, ale jejich velikost je ve srovnání s buňkami reexprimujícími WTCAP1 výrazně menší. V kontrolních buňkách s knockdownem CAP1 nesoucích prázdný vektor (Vec-R) nebyly žádné takové lamellipodie pozorovány. (D) Reexprese WTCAP1 v buňkách PANC-1 s vyřazeným CAP1 snížila počet stresových vláken, zatímco buňky reexprimující mutanty měly stresová vlákna zvětšená. Buňky reexprimující fosforomimetický mutant DD měly nejvíce zesílená stresová vlákna. Šipky označují stresová vlákna nebo jejich absenci v případě buněk WT-R.
Dále jsme se zabývali schopnostmi fosforových mutantů zmírnit zvýšená stresová vlákna v buňkách PANC-1 s vyřazeným CAP1. Jak ukazují konfokální snímky na obr. 4D, reexprese WTCAP1 (WT-R) účinně zmírnila zvýšená stresová vlákna, čímž zachránila fenotyp, a stresová vlákna byla rozpuštěna ve velkých oblastech označených šipkou. Naproti tomu fosforové mutanty byly při zmírňování zvýšených stresových vláken méně účinné. Buňky reexprimující mutant AA měly mírně zesílená stresová vlákna než buňky zachráněné pomocí WTCAP1, zatímco buňky reexprimující mutant DD měly zřejmě ještě více zesílená stresová vlákna. Tyto výsledky jsou v souladu s našimi předchozími zjištěními z buněk HeLa, která naznačují, že defosforylovaný CAP1 je „aktivní“ formou ve vztahu k fosforylovanému CAP124, zatímco přechodná fosforylace je pravděpodobně nutná pro optimální buněčné funkce CAP1. Tyto výsledky rovněž naznačují, že přechodná fosforylace S308/S310 je důležitá pro regulaci aktinového cytoskeletu CAP1 v buňkách rakoviny slinivky břišní; narušení regulace prostřednictvím přechodné fosforylace vede k defektům funkce CAP1 při podpoře obratu aktinových vláken.
Fosforové mutanty CAP1 měly defekty zachraňující sníženou invazivitu u rakovinných buněk s vyřazeným CAP1
Protože dynamický obrat aktinových vláken je primární hnací silou pohybu buněk, testovali jsme dále, jak dobře fosforové mutanty zachraňují sníženou pohyblivost a invazivitu buněk PANC-1 s vyřazeným CAP1. Nejprve jsme provedli Transwellovy migrační testy a zjistili jsme, že reexprese WTCAP1 výrazně zvýšila pohyblivost buněk ve srovnání s kontrolními buňkami, které nesou prázdný vektor, jak ukazují kvantifikované výsledky v grafu (obr. 5A). Reexprimovaný mutant AA (AA-R) sice nebyl tak účinný jako WTCAP1, ale částečně zachránil sníženou pohyblivost buněk v Transwellových migračních testech. Naproti tomu mutant DD (DD-R) sníženou buněčnou motilitu nezachránil a její míra byla srovnatelná s mírou u buněk s vyřazeným CAP1, které nesly prázdný vektor. Tyto výsledky jsou v souladu se schopnostmi při záchraně zvýšených stresových vláken pomocí WTCAP1 a fosforových mutantů. Dále jsme testovali záchranu snížené invaze do Matrigelu v buňkách s knockdownem CAP1, jak ukazují kvantifikované výsledky na obr. 5B. Podobně WTCAP1 zachránil sníženou invazi v buňkách PANC-1 s knockdownem CAP1 nejúčinněji; mutant AA dosáhl částečné záchrany, zatímco mutant DD fenotyp doslova nezachránil. A konečně, reexprese WTCAP1 v buňkách s vyřazeným CAP1 rovněž snížila expresi E-Cadherinu (obr. 5C), což dále potvrzuje, že CAP1 je pro EMT u nádorových buněk PANC-1 nezbytný. Tyto výsledky společně potvrzují, že fosforová regulace prostřednictvím tandemového místa S308/S310 hraje důležitou roli pro CAP1 při podpoře motility a invaze buněk karcinomu pankreatu.
Účinky WTCAP1 a fosforových mutantů při záchraně snížené motility a invaze u buněk PANC-1 s vyřazeným CAP1. (A) WTCAP1 a mutant AA účinně zachránily sníženou pohyblivost u CAP1-knockdown buněk PANC-1 v Transwellových migračních testech, zatímco mutant DD v tomto směru selhal. Experimenty, sběr dat a analýzy byly provedeny podobně, jak je popsáno na obr. 2. Chybové úsečky představují S.E.M. a „*“ označuje P < 0,05 ve srovnání s kontrolními buňkami nesoucími prázdný vektor (Vec-R). (B) WTCAP1 a mutant AA účinně zachránily sníženou invazi buněk PANC-1 s vyřazeným CAP1 do Matrigelu, zatímco mutant DD rovněž ne. Experimenty, sběr dat a analýzy byly provedeny podobně, jak je popsáno na obr. 2. Chybové úsečky představují S.E.M. a „*“ označuje P < 0,05 ve srovnání s kontrolními buňkami. (C) Opětovná exprese WTCAP1 rovněž zachránila zvýšenou regulaci E-Cadherinu v buňkách PANC-1 s vyřazeným CAP1.
Důkazy podporující, že CAP1 zprostředkovává signály extracelulárních růstových faktorů pro kontrolu invazivity nádorových buněk
Je známo, že fyziologické podněty, jako jsou růstové faktory PDGF a HGF (Hepatocytární růstový faktor)36 , stimulují přestavbu aktinového cytoskeletu a migraci buněk. Vzhledem k tomu, že regulace fosforu na S308/S310 je klíčová pro funkci CAP1 při regulaci aktinového cytoskeletu a invazivity nádorových buněk, zkoumali jsme možnost, že tyto podněty mohou regulovat fosforylaci CAP1 a jejím prostřednictvím řídit přestavbu aktinového cytoskeletu a invazivitu nádorových buněk. Zajímavé je, že léčba buněk PANC-1 a AsPC-1 bez séra pomocí PDGF snížila fosforylaci S308/S310 na CAP1, nejmarkantněji v 5minutovém časovém bodě (obr. 6A,B). Léčba buněk karcinomu pankreatu pomocí HGF nebo séra neměla výrazný vliv na vyvolání defosforylace CAP1 (doplňkový obr. 2; zobrazeno pro buňky PANC-1). Signalizace prostřednictvím CAP1 je tedy pravděpodobně alespoň částečně zodpovědná za to, že PDGF stimuluje reorganizaci aktinového cytoskeletu a invazivitu nádorových buněk. Tyto výsledky jsou také v souladu s představou, že defosforylovaný CAP1 je „aktivní“ formou, jak naznačuje řada důkazů včetně vazby na kofilin, subcelulární lokalizace fosforových mutant a zvýšené fosforylace CAP1 v buňkách kultivovaných v suspenzi24. Předpokládá se však, že pro optimální buněčné funkce CAP124 je nutná přechodná fosforylace v tandemovém regulačním místě, konkrétně cyklování mezi fosforylovanou a defosforylovanou formou. Defosforylační signály CAP1 pravděpodobně fungují v kohortu s fosforylačními signály CAP1, aby regulovaly buněčné funkce CAP1 prostřednictvím řízení přechodné fosforylace na S308/S310.
PDGF indukovaná defosforylace CAP1 v buňkách karcinomu pankreatu. (A) Ošetření nádorových buněk AsPC-1 bez séra pomocí PDGF vyvolalo defosforylaci CAP1 na S308/S310. Buňky byly kultivovány přes noc, 24 hodin byly zbaveny séra a poté byly po uvedenou dobu ošetřeny 30 ng/ml PDGF. Byly připraveny buněčné lyzáty a použity k Western blotu s fosforově specifickou protilátkou, která detekuje fosforové signály na obou zbytcích tandemového regulačního místa na CAP1. Efekt defosforylace byl nejvýznamnější v 5minutovém časovém bodě působení PDGF. (B) Léčba buněk PANC-1 zbavených séra pomocí PDGF rovněž vyvolala pozoruhodnou defosforylaci CAP1, podobně jako u buněk AsPC-1. Ošetření buněk a Western blotting byly provedeny stejnými postupy jako u buněk AsPC-1. GAPDH sloužil jako kontrola zatížení při Western blotu.
Deplece CAP1 v buňkách karcinomu pankreatu snížila aktivitu FAK, ale nezpůsobila změny v ERK ani v proliferaci buněk
Nedávno jsme identifikovali novou roli CAP1 v regulaci proliferace buněk karcinomu prsu, kde deplece CAP1 působí na proliferaci v závislosti na buněčném kontextu, což je doprovázeno konzistentními změnami v aktivitě ERK18. Testovali jsme, zda CAP1 může také regulovat ERK a proliferaci v buňkách karcinomu pankreatu. U stabilních klonů PANC-1 s knockdownem CAP1 nebyly zjištěny žádné významné změny v expresi nebo fosforylaci ERK ve srovnání s kontrolními buňkami (doplňkový obr. 3A). Provedli jsme také MTT testy testující proliferaci stabilních knockdown buněk S2-1 a S3-3 a porovnali je s proliferací kontrolních (Vec) buněk a zjistili jsme mírně sníženou míru buněčné proliferace u knockdown buněk (doplňkový obr. 3B). Rozdíly však byly staticky nevýznamné, přičemž hodnota P při porovnání O.D. (při 570 nm) mezi buňkami S2-1 a kontrolními buňkami činila 0,219 a mezi buňkami S3-3 a kontrolními buňkami 0,223. Při porovnání O.D. (při 570 nm) mezi buňkami S2-1 a kontrolními buňkami činila hodnota P 0,223. Tyto výsledky naznačují, že CAP1 nehraje významnou roli v regulaci proliferace u buněk karcinomu pankreatu. Kromě toho jsme vzhledem k celkové tendenci, že paradigma stabilního knockdownu je náchylné ke klonovým variacím, vytvořili pooly buněk PANC-1 se stabilním knockdownem CAP1, o nichž se předpokládá, že přesněji odrážejí účinky deplece CAP1 na ERK, protože se vyhýbají možnému vlivu selekčního zkreslení. Jak ukazuje obr. 7A, po selekci neomycinem byly vytvořeny pooly stabilních buněk PANC-1 s účinným knockdownem CAP1, odvozené z obou konstruktů S2 a S3 shRNA, což bylo potvrzeno při Western blottingu. V souladu se zjištěními z použití stabilních klonů s knockdownem nebyly u poolových buněk s knockdownem zjištěny žádné pozoruhodné změny v expresi ERK nebo její fosforylaci ve srovnání s kontrolními poolovými buňkami.
Buňky PANC-1 s knockdownem CAP1 měly sníženou aktivitu FAK a buněčnou adhezi, ale žádné změny v ERK. (A) Bazénové buňky PANC-1 s knockdownem CAP1, odvozené z konstruktů shRNA S2 i S3, nevykazovaly změněnou expresi nebo aktivitu ERK ve srovnání s kontrolními bazénovými buňkami nesoucími prázdný vektor, jak bylo zjištěno při Western blotu. Aktivita ERK byla detekována ve Western blotu pomocí fosforově specifické protilátky proti místům Thr202/Tyr204. GAPDH sloužil jako kontrola zatížení. (B) V buňkách PANC-1 s knockdownem CAP1 byla zjištěna snížená aktivita FAK ve srovnání s kontrolními buňkami. Aktivita FAK byla hodnocena fosforylací v místě Tyr397 pomocí protilátky specifické pro fosfor proti tomuto místu při Western blottingu; (C) CAP1-knockdown poolové buňky měly sníženou adhezi buněk v testovaných časových bodech (45 minut a 2 hodiny) po nanesení buněk na destičky potažené fibronektinem. Na každou jamku šestijamkové destičky bylo naneseno přibližně 2 × 104 buněk a buňky, které se v uvedených časových bodech nepřichytily, byly smyty. Počet připojených buněk byl spočítán v pěti náhodných polích pod fázovým mikroskopem a byly pořízeny snímky. (D) Údaje získané ze tří nezávislých testů buněčné adheze byly analyzovány pomocí Studentova t-testu a vyneseny do grafu, kde chybové úsečky představují směrodatnou odchylku. „**“ Označuje P < 0,01 ve srovnání s kontrolními buňkami nesoucími prázdný vektor.
Knockdown CAP1 v buňkách karcinomu prsu způsobil odlišné změny FAK u metastatických a nemetastatických buněk karcinomu prsu18. Sníženou aktivitu FAK, aniž by došlo ke změnám v expresi FAK, jsme zjistili také v buňkách karcinomu PANC-1 s knockdownem CAP1 (obr. 7B). Na základě těchto výsledků jsme dále testovali vliv deplece CAP1 na buněčnou adhezi v adhezních testech, podobně jako jsme to prováděli dříve12,18. Zjistili jsme, že poolové buňky s knockdownem CAP1 odvozené z obou shRNA konstruktů měly pozoruhodně sníženou buněčnou adhezi ve srovnání s kontrolními buňkami (obr. 7C). V obou časových bodech (45 minut a 2 hodiny) po nanesení buněk na povrch potažený fibronektinem přilnulo výrazně více kontrolních buněk ve srovnání s buňkami CAP1-knockdown pool. Dále se více připojených kontrolních buněk také plně rozprostřelo (vyvinuly se lamellipodie a buňky nejsou tak jasné) ve srovnání s buňkami s vyřazeným CAP1 (obr. 7C). Pro srovnání jsme hodnotili počty připojených buněk ze tří polí a údaje ze tří nezávislých experimentů byly kvantifikovány tak, jak jsou vyneseny v grafu (obr. 7D).
.