Frontiers | CD44: A Multifunctional Cell Surface Adhesion Receptor Is a Regulator of Progression and Metastasis of Cancer Cells | Cell and Developmental Biology

CD44 Úvod

CD44 je transmembránový glykoprotein označovaný také jako P-glykoprotein 1. Je kódován jedním genem na chromozomu 11p13 (Underhill, 1992; Iczkowski, 2010). CD44 je všudypřítomně exprimován v celém těle a má molekulovou hmotnost 85-200 kDa (Basakran, 2015). Standardní CD44 (sCD44) je konzervovaná forma s molekulovou hmotností přibližně 85-90 kDa proteinu, která je tvořena přepisem exonů 1-5 a 16-20, které jsou sestřihány dohromady (Rall a Rustgi, 1995; Rudzki a Jothy, 1997). Základními doménami CD44 jsou extracelulární doména (neboli ektodoména), transmembránová doména a intracelulární/cytoplazmatická doména (Iczkowski, 2010). Extracelulární doména interaguje s vnějším mikroprostředím a vnímá podněty ve vnějším mikroprostředí (Underhill, 1992). Transmembránová doména poskytuje možnost interakce s kofaktory a adaptorovými proteiny a také usměrňuje navádění lymfocytů (Underhill, 1992; Williams et al., 2013). Intracelulární doména CD44 (CD44-ICD) má krátkoocasou a dlouhoocasou konfiguraci s funkcemi v jaderné lokalizaci a zprostředkování transkripce (Okamoto et al., 2001; Williams et al., 2013). Naše současné poznatky o dvojí roli CD44 v progresi rakoviny jsou shrnuty na obrázku 1 níže.

OBRÁZEK 1

Obrázek 1. Funkce transmembránového receptoru CD44. CD44, multifunkční receptor, může řídit biologické funkce podílející se na šíření nádorových buněk a metastazování. CD44 může být postupně štěpen membránovou metaloproteázou typu 1 (MT1-MMP) a poté presenilin-1/γ sekretázou vyvolanou vazbou ligandů. Štěpením vzniká (1) fragment extracelulární domény (ECD). (2) peptid podobný CD44β nebo transmembránová doména (TMD) a (3) fragment intracelulární domény CD44 (ICD). CD44-ICD se přemisťuje do jádra, kde aktivuje transkripci genů důležitých pro metastazování a přežívání buněk. Převzato z Thorne et al., 2004.

Isoformy CD44

Více izoforem CD44 může vzniknout v důsledku vložení alternativních exonů na specifická místa v extracelulární doméně (Cichy a Puré, 2003). Variantní izoformy CD44 (CD44v) se skládají z exonů 6-15 sestřihaných na různých místech mezi exony 5 a 16 standardní izoformy (Goodison et al., 1999; Zeilstra et al., 2014). Exprese odlišných izoforem CD44 se zdá být nezbytná pro progresi lidských nádorů (Günthert et al., 1995; Wang et al., 2009). V nádorových buňkách může být exprimována jedna nebo více sestřihových variant a standardní CD44. Existuje zvýšená pravděpodobnost exprese větších izoforem, jako je izoforma CD44v8-10 u rakoviny slinivky břišní (Rall a Rustgi, 1995) a CD44v6 u kolorektálního karcinomu (Yamane et al., 1999). Exprese CD44v6 je dobře známá jako užitečný marker progrese nádoru a prognózy u kolorektálního karcinomu (Yamane et al., 1999). V kultivovaných supernatantech z buněčných linií karcinomu prostaty odvozených od kostních metastáz (PC3) byla identifikována solubilní CD44 a izoforma varianty 6 (v6), nebyla však identifikována v buněčné linii karcinomu prostaty metastazujícího do lymfatických uzlin (LNCaP, Stevens et al., 1996; Desai et al., 2009; Gupta et al., 2012). Přechod ze standardního CD44 na CD44v6 zlepšil přežití a adhezi u buněk karcinomu prostaty (PC3) (Gupta et al., 2013b). Exprese CD44v6 u kolorektálního karcinomu zvyšuje expresi nádorových kmenových buněk (Todaro et al., 2014).

Exprese CD44 v normálních a nádorových buňkách

Všudypřítomná transmembránová povrchová buněčná molekula CD44 je široce rozšířena v normálních tkáních dospělých a plodu. Standardní izoforma CD44 byla původně izolována z hematopoetických buněk, ale nyní se nachází v různých tkáních, např. v centrálním nervovém systému, plicích a epidermis. Oproti tomu distribuce variantní izoformy CD44 je omezená a je exprimována na vybraných epiteliálních buňkách (Sneath a Mangham, 1998). Izoformy s omezenou distribucí a sekvencí exonů mohou mít odlišné funkce ve srovnání se standardní izoformou CD44. Keratinocyty, makrofágy a vybrané epiteliální buňky exprimují variantní izoformy CD44 (CD44v) a jsou přítomny na tkáních v různých stadiích vývoje (Sneath a Mangham, 1998). V normálních tkáních má CD44 zásadní význam pro regulaci metabolismu hyaluronu, aktivaci lymfocytů a uvolňování cytokinů. Avšak cílení CD44 vedoucí k jeho ztrátě vede k narušení metabolismu hyaluronu, hojení ran a proliferace keratinocytů (Yu a Stamenkovic, 1999). Jednou z mnoha funkcí CD44 je, že buněčné linie, které nejsou metastatické, se stávají metastatičtějšími (Heider et al., 1993). Podrobnosti, které propůjčují CD44 metastatický potenciál u lidských malignit, jsou předmětem dalšího objasňování. Buňky prostaty, které jsou benigní, exprimují vyšší množství izoforem CD44 varianty 5 (CD44v5), zatímco neoplastické buňky prostaty exprimují vyšší množství CD44 (Dhir et al., 1997; Desai et al., 2009; Gupta et al., 2013a). Různé buňky karcinomu prsu vykazují abnormální expresi CD44 včetně heterogenně exprimujících izoforem CD44 (Basakran, 2015).

Interakce receptoru CD44 s ligandem

CD44 je známý tím, že interaguje s různými ligandy a tato interakce je klíčová pro jeho mnohé buněčné funkce (Goodison et al., 1999). Existuje několik dobře známých ligandů CD44 včetně kyseliny hyaluronové (HA), osteopontinu (OPN), kolagenů a matrixových metaloproteináz (MMP) (Goodison et al., 1999). Účinky CD44 na migraci a růst buněk závisí na jeho specifičnosti vůči ligandům (Weber et al., 1996).

Hyaluronan (HA)

HA je glykosaminoglykan, který je všudypřítomnou součástí extracelulární membrány. Je považován za hlavní ligand pro CD44 a může vázat izoformy CD44v, které jsou všudypřítomně exprimovány. Prostřednictvím vazby na CD44 může HA aktivovat cytoskelet a signalizaci matrixových metaloproteináz (MMP), které se podílejí na progresi nádorů (Bourguignon et al., 2014). Více oblastí cytoplazmatické domény CD44 může podporovat zesílení vazby HA, avšak úloha cytoplazmatické domény při zprostředkování vazby nevyžaduje specifickou sekvenci aminokyselin v T-lymfomových buňkách (Perschl et al., 1995). HA může existovat ve vysokomolekulární nebo nízkomolekulární formě v důsledku štěpení na různé velikosti. U buněčných linií karcinomu prsu se vysokomolekulární HA podílí na tumorigenezi, antiangiogenní a protizánětlivé reakci. Bylo však prokázáno, že nízkomolekulární HA podporuje buněčnou motilitu, štěpení CD44 a angiogenezi. Velikost ligandu HA je tedy důležitá pro biologickou funkci (Louderbough a Schroeder, 2011).

Osteopontin (OPN)

Několik studií prokázalo zvýšenou expresi OPN u vysoce invazivních metastazujících lidských nádorů (Tuck et al., 2007). Integrin αvβ3 a CD44 jsou receptory pro OPN a mohou interagovat s αvβ3 prostřednictvím jeho funkční arginin-glycin-asparagové sekvence (RGD) vázající buňky (Thalmann et al., 1999; Desai et al., 2007). Ukazuje se, že růst a progrese karcinomu prostaty jsou zprostředkovány parakrinní a autokrinní signalizací OPN (Thalmann et al., 1999). Interakce CD44-OPN vyvolává migraci buněk z krevního řečiště do míst zánětu. Migrace buněk a následná invaze na vzdálená místa zahrnuje složitý sled událostí (Weber et al., 1996). Variantní izoformy CD44 se vážou na OPN nezávisle na sekvencích RGD přítomných v N-koncové doméně CD44 (Katagiri et al., 1999). Vazba OPN na varianty CD44/integrin obsahující beta1 podporuje šíření, pohyblivost a chemotaktické chování buněk u karcinomu slinivky břišní u potkana (Katagiri et al., 1999). OPN zvyšuje povrchovou expresi standardního CD44 (sCD44) u osteoklastů a sCD44 i variantních izoforem u lidských melanomových a PC3 buněk (Chellaiah et al., 2003; Samanna et al., 2006; Desai et al., 2007). Osteopontinová regulace povrchové exprese CD44v6 a sCD44 byla pozorována u buněk karcinomu prsu a hepatocelulárního karcinomu (Gao et al., 2003; Khan et al., 2005).

Matrixové metaloproteinázy (MMPs)

Matrixové metaloproteinázy (MMPs) jsou důležité proteiny extracelulární matrix, které se podílejí na degradaci extracelulární matrix. Jsou také důležité během vývoje, hojení ran, resorpce kostí a angiogeneze (Paiva a Granjeiro, 2014). Existují důkazy naznačující, že MMP-9 a CD44 se spojují v myších a lidských nádorových buňkách, což vede k lokalizaci aktivity MMP9 na povrchu buněk (Yu a Stamenkovic, 1999; Gupta a kol., 2013a). Interakce CD44 a proteolytické formy MMP-9 se podílí zejména na invazi buněk karcinomu prostaty (PC3) odvozených z kostních metastáz (Desai et al., 2007). Schopnost CD44 lokalizovat proteolyticky aktivní MMP-9 na povrchu nádorových buněk je tedy důležitá pro nádorovou invazi (Yu a Stamenkovic, 1999).

Úloha CD44 v migraci/invazi, angiogenezi a kostních metastázách

Migrace a invaze

Registr CD44 má potenciál integrovat adhezivní a signální aktivity k modulaci migračních/invazivních procesů během progrese rakoviny (Lokeshwar et al..), 1995). Mechanismy, kterými receptory CD44 zprostředkovávají migraci, proliferaci a přežití nádorových buněk prostřednictvím signalizace zprostředkované HA, byly široce studovány (Bourguignon et al., 1998, 2001, 2004; Kuniyasu et al., 2001; Wang a Bourguignon, 2006a,b; Wang et al., 2009). Změny tvaru buněk a tvorba adhezivních struktur jsou regulovány dynamickou regulací aktinového cytoskeletu. Dynamická regulace aktinového cytoskeletu a specializovaných struktur podílejících se na migraci je regulována časovou a prostorovou lokalizací proteinů vážících aktin (Chellaiah a kol., 2000; Linder a Aepfelbacher, 2003; Desai a kol., 2008). Povrchová exprese CD44 spolu s jeho interakcí s matrixovou metaloproteinázou 9 (MMP9) na povrchu buňky vede k sekreci aktivní MMP9, migraci a invazi buněk PC3 (Desai et al., 2007, 2008; Gupta et al., 2013a). Přerušení interakce CD44/MMP9 na povrchu buněk snižuje migraci a invazi buněk PC3. Při vyřazení MMP9 se exprese CD44 přepne na izoformu varianty 6 (v6). To vede k méně invazivnímu fenotypu v důsledku nedostatečné exprese sCD44 a neschopnosti tvořit invadopodie (Gupta et al., 2013a). Exprese CD44v6 inverzně koreluje s patologickým stadiem a progresí onemocnění a pozitivně koreluje s přežitím bez PSA u karcinomu prostaty (Ekici et al., 2002). Bylo však prokázáno, že exprese CD44v6 v nemetastazujících buňkách karcinomu potkana je mění na metastazující buňky a podporuje progresi nádoru (Günthert et al., 1991; Seiter et al., 1993). Dále bylo prokázáno, že CD44v3 reguluje funkci cytoskeletu prostřednictvím ankyrinu k aktivaci aktomyozinového kontraktilního komplexu za účelem zprostředkování buněčné migrace v buněčné linii dlaždicového karcinomu hlavy a krku. Transfekce cDNA v3 do neexprimujících buněčných linií také vedla k významnému zvýšení buněčné migrace, nikoli však proliferace (Franzmann et al., 2001; Wang et al., 2007). Bylo také prokázáno, že varianty CD44 fungují jako koreceptor pro aktivaci tyrozinkináz nádorových receptorů podporujících růst (Orian-Rousseau et al., 2002, 2007).

Angiogeneze

Tvorba nových krevních cév (angiogeneze) je nezbytná pro šíření nádorových buněk a jejich migraci do vzdálených orgánů. Dřívější studie identifikovaly expresi CD44 na endoteliálních buňkách (Liesveld et al., 1994; Xu et al., 1994) a ta řídí tvorbu cév (Trochon et al., 1996; Savani et al., 2001). Inhibice CD44 proto vede k poruše tvorby cévních sítí (Savani et al., 2001; Cao et al., 2006). Endoteliální buňky byly nalezeny ve zvýšeném počtu ve tkáních karcinomu prostaty ve srovnání s normálními tkáněmi (Wang et al., 2013). Když byly CD44-nulové myši použity ke studiu angiogenních reakcí in vivo, hojení ran i vaskularizace v matrigelových implantátech byly narušeny. Tvorba metastáz je tedy rovněž spojena s vaskulární expresí CD44 (Cao et al., 2006). Adheze nádorových buněk k cévám a zvýšená exprese CD44 (CD44s a/nebo CD44v) angiogenními faktory (např. VEGF) produkovanými nádorovými buňkami může vést k usnadněné extravazaci prostřednictvím angiogeneze. Úloha CD44 v nádorové angiogenezi je navíc posílena jeho vazbou na imobilizovanou HA (Griffioen et al., 1997). Ukázalo se, že varianty CD44 mají vazebné domény pro různé růstové faktory včetně vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF), základního fibroblastového růstového faktoru vázaného na heparin a epidermálního růstového faktoru vázaného na heparin (Bourguignon et al., 1998, 1999; Kalish et al., 1999). Analýza tkáňových mikročipů a lyzátů prostatických nádorových buněk ukázala, že exprese OPN a VEGF je výraznější u karcinomu prostaty ve srovnání s benigní nebo normální tkání prostaty. Bylo navrženo, že zvýšení počtu mikrocév a exprese CD44 by mohly být užitečnými diagnostickými markery metastazování karcinomu prsu (Ozer et al., 1997).

Metastazování do kostí

Schopnost buněk karcinomu prsu a prostaty metastazovat do kostí je založena na jejich schopnosti zadržet se na endotelu kostní dřeně, přilnout k němu a extravazovat přes něj do základní kostní matrix (Draffin et al., 2003). U buněk karcinomu prostaty je selektivní adheze těchto buněk k epitelu kostní dřeně založena na roli adhezivních vlastností integrinových receptorů. Buňky karcinomu prostaty se podílejí na silné interakci s endotelovými buňkami kostní dřeně (Draffin et al., 2004). V současné době existuje v literatuře rozpor mezi klinickými a experimentálními údaji týkajícími se významu sCD44 v progresi onemocnění karcinomu prsu. Nedávná studie naznačuje, že modely karcinomu prsu vykazují expresi standardních a variantních izoforem CD44, které zvyšují progresi onemocnění a metastatické chování (McFarlane et al., 2015). HA a CD44 se společně lokalizují v sinusoidálním epitelu kostní dřeně, který je místem metastazování karcinomu prsu. To naznačuje podíl HA-CD44 na účinnosti vzdáleného metastazování do kostí u buněk karcinomu prsu (McFarlane et al., 2015). Buňky produkující nízké hladiny CD44 mají nižší schopnost tvořit nádorovou sféru in vitro. CD44 je navíc markerem nádorových kmenových buněk (Jaggupilli a Elkord, 2012; Cho et al., 2015; Stivarou a Patsavoudi, 2015) a nádorové kmenové buňky exprimující CD44 zvyšují pravděpodobnost kostních metastáz díky interakci s HA. Interakce CD44-HA by proto mohla být potenciálním cílem pro snížení počtu kostních metastáz. Bylo také prokázáno, že signalizace CD44 v buňkách karcinomu prostaty reguluje klíčové proteiny (tj. RANKL a MMP9), které se podílejí na diferenciaci osteoklastů a metastazování nádorů (Gupta et al., 2012). Runx2 je hlavní transkripční faktor s důležitou rolí v diferenciaci osteoblastů. Transkripce mnoha faktorů souvisejících s osteoblasty a tvorbou kostí, jako jsou OPN, osteokalcin a kolagen typu I, je regulována Runx2 (Akech et al., 2010).

Role of CD44 as a Transcriptional Factor

Proteolytické štěpení, ke kterému dochází na extracelulární doméně a při kterém se uvolňuje rozpustný CD44, je známo již dlouho. Nedávné studie však ukázaly, že CD44 může projít dalším sekvenčním proteolytickým zpracováním membránovými metaloproteázami typu 1 (MT1-MMP) a presenilin-1/y-sekretázou za vzniku fragmentů extracelulární domény a intracelulární domény (ICD). Ke štěpení presenilinu-1/y-sekretázy dochází v intramembránovém místě za uvolnění dvou štěpných produktů o velikosti ~25 a ~16 kDa. ICD o velikosti 12 kDa se přemisťuje do jádra, kde aktivuje transkripci několika proteinů včetně samotného CD44 (Okamoto et al., 2001; Nagano a Saya, 2004; Thorne et al., 2004). Pokud tedy lze toto štěpení inhibovat pomocí inhibitorů metaloproteáz, může sloužit jako terapeutický způsob prevence progrese nádoru a metastazování (Nagano a Saya, 2004). Translokace CD44-ICD do jádra zahajuje proces transkripční regulace prostřednictvím jeho vazby na nový promotorový element odpovědi, čímž reguluje transkripci několika genů, které se podílejí na přežití buněk během stresu, zánětu, oxidativní glykolýzy a nádorové invaze (Okamoto et al., 2001; Miletti-González et al., 2012). To naznačuje mechanismus multifunkční role CD44 v metastazování a metabolismu nádorových buněk (Miletti-González et al., 2012). Ukázalo se také, že jaderná translokace intracelulární domény interaguje s kmenovými faktory (Cho et al., 2015). CD44-ICD je spojena s regulací genu MMP-9 v buňkách karcinomu prostaty a prsu prostřednictvím interakce s transkripčním faktorem RUNX2 (Miletti-González et al., 2012).

Závěry

Multifunkční glykoprotein CD44 může podléhat alternativnímu sestřihu za vzniku variantních izoforem CD44, které mají omezenější distribuci ve srovnání se standardními izoformami CD44 (Rall a Rustgi, 1995). Všudypřítomně exprimovaný protein na povrchu buněk se podílí především na agregaci, migraci a aktivaci buněk, tyto funkce jsou zprostředkovány adhezivními vlastnostmi CD44 (Heider et al., 1993). Původně byl popsán pro hematopoetické kmenové buňky, od té doby byl potvrzen jako marker nádorových kmenových buněk (Bourguignon et al., 1998). CD44 interaguje s řadou ligandů a může podléhat sekvenčnímu proteolytickému zpracování, jehož výsledkem je vznik CD44-ICD. Je známo, že CD44-ICD se přemisťuje do jádra, kde aktivuje transkripci genů (Okamoto et al., 1999). Ačkoli zde uvedené informace poskytují ucelený přehled dosavadní literatury, existuje určitá diskuse o účinku ICD jako hlavního modulátoru metastatických dějů u nádorových onemocnění. K dalšímu zdůvodnění účinku CD44 při metastazování bude třeba dokončit specifický výzkum, který se tím bude zabývat.

Příspěvky autorů

LS a MC vypracovali návrh rukopisu a stejnou měrou se podíleli na úpravách a přepisování konečného obsahu.

Financování

Tato práce byla podpořena výzkumným grantem pro MC od National Institute of Health – National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (5R01AR066044).

Prohlášení o střetu zájmů

Autoři prohlašují, že výzkum byl prováděn bez jakýchkoli komerčních nebo finančních vztahů, které by mohly být chápány jako potenciální střet zájmů.

Akech, J., Wixted, J. J., Bedard, K., van der Deen, M., Hussain, S., Guise, T. A., et al. (2010). Souvislost Runx2 s progresí karcinomu prostaty u pacientů: mechanismy zprostředkující kostní osteolýzu a osteoblastické metastatické léze. Oncogene 29, 811-821. doi: 10.1038/onc.2009.389