Immunocytochemie u intraepiteliální neoplazie a invazivní rakoviny
Klasifikace intraepiteliální neoplazie děložního hrdla, se cytopatologové spoléhají na cytomorfologická kritéria, jako je jaderná hyperchromázie, jaderná atypie a nukleocytoplazmatický poměr. Tato forma klasifikace nemůže předpovědět biologické chování lézí CIN. Je vyvinuto obrovské množství biologických markerů nebo náhradních koncových biomarkerů, které jsou do značné míry použitelné pro histologické tkáně děložního hrdla. Tyto markery jsou obvykle představovány jako „velmi slibné“ při správné predikci regresivního nebo progresivního chování cervikálních lézí. V každodenní praxi je použitelnost těchto markerů spíše zklamáním. Jelikož první pozorování naznačují, že CIN zahrnuje progresivní poruchu proliferační aktivity epiteliálních buněk děložního hrdla, většina vyvinutých biologických markerů jsou proteiny, které hrají klíčovou roli v regulačních drahách buněčného cyklu. Pro rozsáhlý přehled těchto biologických markerů, vybavených zejména pro histologii děložního čípku, odkazujeme na kapitolu 1. V cervikální cytologii je výběr biologických markerů historicky mnohem omezenější, protože screening se provádí pomocí stěrů barvených Papanicolaouem a obvykle není k dispozici žádný zbytkový materiál pro další výzkum. Navíc pokud chce být imunocytochemie na přímých mokrých cytologických vzorcích, jako je tekutá cytologie, úspěšná, je nutná mírná krátká fixace v alkoholech nebo acetonu. Pouze ve vysoce kvalifikovaných a dobře kontrolovaných laboratořích lze tuto mírnou fixaci provést správně, aby bylo možné získat reprodukovatelné výsledky imunocytochemického barvení. Tento problém se v histologii nevyskytuje díky robustní rutinní fixaci tkání ve formalínu.
Vývoj řetězově specifických monoklonálních protilátek (mAbs) proti jednotlivým keratinům umožňuje imunocytochemicky rozlišit rezervní buňky, nezralou a zralou dlaždicovou metaplazii a normální ektocervikální dlaždicový a endocervikální sloupcový epitel, jakož i různé typy epiteliálních abnormalit (CIN stupně 1, 2 a 3).123,228-230
Při použití několika monoklonálních protilátek namířených proti různým epitopům téhož keratinového polypeptidu (např. různé mAbs proti keratinu 18) je možné detekovat strukturální změny v důsledku biologické aktivity nebo neoplastické transformace. Pomocí protilátek proti keratinu 10 nebo 13 lze určit stupeň diferenciace dlaždicobuněčného karcinomu. Keratin 10 je markerem keratinizace. Může být exprimován v buňkách povrchovějších vrstev dlaždicového epitelu, i když světelně mikroskopicky nejsou zjistitelné žádné známky keratinizace.
Široce zkříženě reagující mAbs dávají pozitivní reakce prakticky ve všech epiteliálních tkáních a primárních a metastatických epiteliálních karcinomech, včetně dlaždicobuněčných karcinomů různých stupňů diferenciace a malobuněčných anaplastických karcinomů. Protilátky proti keratinu 18 mohou mimo jiné rozpoznat adenokarcinomy, ale obvykle nereagují s dlaždicobuněčnými karcinomy.231 Adenokarcinomy jsou téměř vždy negativní na keratiny 5, 10, 13 a 16. V případě adenokarcinomů jsou protilátky proti keratinu 18 negativní. Dlaždicobuněčné karcinomy jsou téměř vždy pozitivní na keratiny 5, 10 a 13. Exprese keratinu 16 je omezena na keratinizující dlaždicobuněčné karcinomy. mAbs proti keratinu 7 obecně neposkytly žádnou barvicí reakci s (keratinizujícími) dlaždicovými epiteliemi. Tato protilátka reaguje se sloupcovitými buňkami děložního hrdla.232
Moll a spolupracovníci prokázali přítomnost cytokeratinů 5, 7, 8, 17, 18 a 19 u nezralé dlaždicové metaplazie a změněný vzorec exprese keratinů u zralého dlaždicového epitelu a mírné dysplazie233 (obr. 8.125). U invazivního karcinomu zjistili podobný vzorec jako u zralého dlaždicového epitelu.
Smedts a kolegové u abnormálního epitelu děložního hrdla zjistili nepravidelnou distribuci cytokeratinů 10, 11, 13 a 16 u CIN 3. stupně.234,235 Zaznamenali patchový vzorec distribuce pozitivity. Oblasti pozitivity se střídaly s negativními oblastmi. Nepodařilo se jim prokázat konzistentní a progresivní změnu obsahu cytokeratinů od normálního epitelu přes CIN 1. a 2. stupně. Jejich pozorování naznačují, že v době vzniku léze morfologicky popsané jako CIN 3. stupně došlo k náhlé změně. Léze CIN 2. stupně v invaginacích endocervikálního kanálu měly identický obraz jako léze na povrchu kanálu. Vzor barvení u CIN stupně 3 byl srovnatelný se vzorem zjištěným u invazivního dlaždicobuněčného karcinomu. Puts a spolupracovníci použili anticytokeratinové protilátky proti keratinům a nezjistili žádné kvalitativní rozdíly v barvicích reakcích mezi epiteliálními lézemi různého stupně závažnosti.236 U 32 dysplastických lézí zjistili variabilní počet Langerhansových buněk, ale žádný specifický vzorec v distribuci mezi lézemi různé závažnosti.6 Spekulovali, že rozdíly v počtu Langerhansových buněk by mohly souviset s rozdíly v dysplastických procesech a také s rozdíly v reakci hostitele, a mohly by tak potenciálně být ukazatelem tendence k regresi nebo progresi.
Smedts a spolupracovníci zkoumali expresi keratinů v normálních epiteliích děložního hrdla, metaplastickém epitelu a CIN stupně 1, 2 a 3 pomocí panelu mAbs specifických pro jednotlivé řetězce.237,238 To umožnilo detekovat jednotlivé keratiny 4, 5, 7, 8, 10, 13, 14, 18 a 19 na úrovni jedné buňky. Výsledky ukázaly, že během transformace rezervních buněk v nezralou dlaždicovou metaplazii získal tento epitel keratiny typické pro ektocervikální dlaždicový epitel, zatímco keratiny typické pro rezervní a sloupcovité buňky se ztratily. Tato změna pokračovala i během další diferenciace do zralé dlaždicové metaplazie. Premaligní transformace vedla k částečné ztrátě keratinů typických pro dlaždicový epitel a získání keratinů atypických pro jednoduché epitelie.
V průběhu narůstající epiteliální atypie přes stupeň 1 až 3 intraepiteliální neoplazie se v dysplastických lézích objevují keratiny charakteristické pro jednoduché epitelie (obr. 8.126). U CIN 1. stupně přibližně polovina a u CIN 2. stupně (středně těžká dysplazie) třetina případů vykazuje určitou rozptýlenou pozitivitu keratinů 8 a 18, zatímco keratin 19, který u zralého dlaždicového epitelu barví bazální vrstvy, nyní vykazuje ztrátu polarity a barví stále větší část celé tloušťky dysplastického epitelu, často nepravidelně.
V porovnání se zralým dlaždicovým epitelem se exprese keratinů 4, 5, 13 a 14 snížila a vzor barvení se stal variabilním (obr. 8.127 a 8.128). To naznačuje, že dysplastický epitel v souvislosti s progresí závažnosti abnormality postupně ztrácel svůj skvamózní keratinový fenotyp a získával keratinové charakteristiky jednoduchého epitelu.
Tyto změny byly ještě zřetelnější v případech CIN 3. stupně; ve všech případech byla exprese keratinů 8 a 18 hojná a exprese keratinů 13 a 14 se snížila, v některých oblastech zcela chyběla. To zdůraznilo zvýšenou expresi keratinového vzoru charakteristického pro jednoduchý epitel s narůstajícími dysplastickými změnami.
Keratiny 8, 18 a 19 byly nalezeny u dlaždicobuněčných karcinomů děložního hrdla i u adenokarcinomu. Exprese těchto keratinů v rezervních buňkách může naznačovat, že tyto buňky jsou běžnými progenitorovými buňkami s dvojím diferenciačním potenciálem, na jedné straně prostřednictvím fáze metaplazie do dlaždicových epiteliálních abnormalit a na druhé straně prostřednictvím diferenciace do abnormalit sloupcovitého buněčného typu. Zdá se, že dvojí exprese keratinů dlaždicobuněčného a sloupcovobuněčného typu u nezralé dlaždicové metaplazie tuto hypotézu podporuje.228,229