Chiméra byla v řecké mytologii bytost obvykle představovaná jako složenina lva, kozy a hada. Současné používání termínu „chimérismus“ při transplantaci krvetvorných buněk vychází z této představy „smíšené“ entity a označuje někoho, komu byla transplantována geneticky odlišná tkáň. Test na chimérismus po transplantaci krvetvorných kmenových buněk zahrnuje identifikaci genetických profilů příjemce a dárce a následné vyhodnocení míry smíšenosti v krvi, kostní dřeni nebo jiné tkáni příjemce.
Testování chimérismu (analýza přihojení) pomocí DNA využívá metodiku běžně používanou při testování lidské identity a provádí se pomocí analýzy genomických polymorfismů nazývaných lokusy krátkých tandemových repetic (STR). Tyto lokusy se skládají ze základní sekvence DNA, která se v rámci diskrétního genetického lokusu opakuje různý početkrát. Termín STR, označovaný také jako mikrosatelity, se vztahuje k počtu párů bází tandemově se opakující základní sekvence DNA, jejíž délka se pohybuje v rozmezí 2-8 párů bází. Tyto lokusy vykazují alely, které se mohou u jednotlivých jedinců lišit v délce a dědí se jako kodominantní mendelovské znaky. Lokusy STR byly identifikovány v celém lidském genomu a některé lokusy mají více než 25 alel.
K vytvoření párů oligonukleotidových primerů pro STR se používají informace o sekvenci DNA v konzervovaných doprovodných oblastech lokusů. Tyto primery se používají při PCR (polymerázová řetězová reakce) amplifikaci testovaných vzorků. Tato technika může amplifikovat sekvenci STR až miliardkrát a poskytnout materiál, který lze oddělit pomocí elektroforetického gelu nebo kapilární elektroforézy (CE). Genotypizace se provádí vyhodnocením velikosti fragmentů DNA. Pro přesnou identifikaci alel STR lze použít odkaz na alelický žebříček.
Systém STR/CE založený na PCR má oproti jiným metodám analýzy několik výhod. Amplifikaci více STR lokusů lze kombinovat (multiplexovat) v jedné zkumavce, což umožňuje analýzu až šestnácti lokusů v jedné reakci. Vzhledem k tomu, že je zapotřebí nepatrné množství DNA, lze použít vzorky s nízkým počtem buněk a malá velikost alel STR umožňuje použít i vzorky degradované DNA. Digitální data usnadňují analýzu a archivaci a proces CE je rychlý a nákladově efektivní. Amplifikace PCR a analýza lokusů STR poskytuje rychlou a spolehlivou metodu pro hodnocení stavu přihojení v rámci transplantace kmenových buněk.
Současně používaná technologie umožňuje koamplifikaci a tříbarevnou detekci šestnácti lokusů, které jsou rozděleny do tří sad po 5 nebo 6 lokusech, které vykazují amplifikované fragmenty s nepřekrývajícími se rozsahy velikostí.
V průběhu kroku amplifikace PCR jsou amplifikované fragmenty označeny fluorescenčními barvivy. Po amplifikaci PCR jsou vzorky zpracovány na systému kapilární elektroforézy (CE).
Analýzu dat usnadňuje software pro analýzu fragmentů, který určuje velikost fragmentů DNA pomocí vnitřního standardu pruhu prováděného se vzorkem a přiřazuje genotypy porovnáním s žebříčkem alel STR, který je součástí běhu CE. To poskytuje odlišné STR genotypové profily pro dárce a příjemce transplantátu. Lokusy STR, které jsou polymorfní (tj. informativní) mezi těmito jedinci, se používají k posouzení relativního množství DNA příjemce a dárce v potransplantačním vzorku.
Testované vzorky mohou pocházet z jakéhokoli materiálu obsahujícího DNA, včetně kostní dřeně, periferní krve, solidních nádorů, epidermální tkáně, vlasových folikulů, bukálních stěrů a frakcionovaných buněčných podskupin. Vzhledem k tomu, že amplifikace vzorku pomocí PCR se běžně provádí s méně než 2 ng genomové DNA (což odpovídá přibližně 300 buňkám), lze testování chimérismu touto metodou úspěšně provádět i u pacientů se selháním štěpu, těžkou leukopenií nebo z podskupin krvetvorných buněk. Analýza STR byla použita k vyhodnocení stavu přihojení u pacientů, kteří obdrželi transplantaci krvetvorných buněk, včetně pacientů, kteří obdrželi dvojitou jednotku pupečníkové krve nebo druhou transplantaci od jiného dárce, a také k potvrzení genetické identity domnělých jednovaječných dvojčat a ke zjištění přihojení mateřských buněk získaných inutero u pacientů s diagnózou těžké kombinované imunodeficience (SCID). Analýza STR/CE je rychlý, spolehlivý, přesný a reprodukovatelný postup.
Omezení testu
- Z testovaných vzorků musí být izolováno dostatečné množství DNA, aby byla umožněna robustní amplifikace PCR. Musí být k dispozici metody izolace DNA pro zpracování vzorků s nízkým počtem buněk, s jakými se lze setkat například u příjemců se selháním štěpu a z podskupin bílých krvinek tříděných průtokovou cytometrií podle linie. Vzorky mohou mít příliš nízké koncentrace pro kvantifikaci pomocí UV spektrofotometrie OD260. Vzorky DNA z 5 000 až 30 000 izolovaných buněk spolehlivě poskytují přijatelnou amplifikaci. Laboratoř má pokyny, které definují, kdy by se měla analýza vzorku opakovat.
- U komerčních souprav má mnoho lokusů STR informativní alely pro dárce i příjemce v případě nepříbuzných dárců. Počet informativních STR lokusů však může být omezen na pouhé 3 u příbuzenských transplantačních párů dárců. Bylo zjištěno, že kvantitativní hodnoty představující průměr pouhých 3 lokusů STR jsou reprodukovatelné.
- Pacienti s maligním onemocněním mohou mít klonální mutace, které ovlivňují některé lokusy STR. Při porovnání alel identifikovaných ve vzorku pacienta před transplantací a ve vzorku po transplantaci může u jednoho nebo více lokusů STR alela pacienta chybět. Za vzácných okolností může být na určitém lokusu zjištěna další pacientova STR alela, která nebyla přítomna ve vzorku před transplantací. Ve většině případů jsou tyto anomálie pravděpodobně způsobeny chromozomovými translokacemi. Chybějící alely mohou být také důsledkem mutace v konzervativních doprovodných sekvencích STR, kde se nacházejí primery PCR. Údaje z lokusů STR s chybějícími nebo nadbytečnými alelami se pro kvantifikaci nepoužívají.
- Pokud nejsou k dispozici buňky pacienta před transplantací, lze po transplantaci odebrat vzorky, jako jsou bukální stěry, kožní biopsie nebo vlasové kořínky. Je však třeba poznamenat, že bukální vzorky mohou obsahovat značné množství dárcovských buněk.
- Test není určen k detekci minimální reziduální choroby.
Klinické indikace pro testování chimerismu při transplantaci krvetvorných buněk
Rutinní potransplantační dokumentace původu bílých krvinek dárce/příjemce v periferní krvi a/nebo dřeni. Dokumentace přihojení může zahrnovat testování buněčných podskupin specifických pro danou linii, jako jsou CD3 pozitivní T-buňky a CD33 pozitivní myeloidní buňky.
Vyhodnocení buněk dárce/příjemce u pacientů s nedostatečnou funkcí dřeně.
Určit, zda recidivující nebo nová malignita pochází z buněk příjemce nebo dárce.
Zhodnotit prognostická rizika rejekce a recidivy malignity.
Dokumentovat přetrvávání dárcovských buněk po transplantaci u pacientů s recidivujícím onemocněním nebo před infuzí dárcovských lymfocytů (DLI).
Zhodnoťte, zda u příjemců, kteří jsou kandidáty na druhou transplantaci, došlo k rejekci štěpu.
Zjistěte původ dárcovských buněk u příjemců, kteří podstoupili druhou transplantaci s jiným dárcem nebo transplantaci s dvojitými jednotkami pupečníkové krve.
Detekovat přítomnost buněk odvozených od matky u pacientů s diagnózou těžké kombinované imunodeficience (SCID).
Ověřit genetickou identitu domnělých jednovaječných dvojčat.
Často kladené otázky
Dotaz: Jak se analyzují vícenásobní dárci?
Odpověď:
Dotaz: Je nezbytné identifikovat STR lokusy, které vykazují alespoň jednu jedinečnou STR alelu pro pacienta a každého dárce: Proč se testuje přihojení u matky?
Odpověď: Proč se testuje přihojení u matky? U pacientů s diagnózou těžké kombinované imunodeficience (SCID) mohlo dojít k vštípení krvetvorných buněk mateřského původu v děloze. Některé podskupiny buněk specifické pro danou linii (zejména CD3-pozitivní buňky) mohou být převážně nebo zcela mateřského původu.
Dotaz: Jaký je rozdíl mezi „plným“ a „smíšeným“ chimérismem?
Odpověď: „
„Smíšený“ chimérismus označuje pacienta, který po transplantaci vykazuje v hematopoetických buňkách fenotyp, který je celý dárcovského původu.
Dotaz: Co když není k dispozici základní vzorek příjemce?
Odpověď: Pro získání vzorku příjemce po transplantaci je k dispozici několik možností: pro základní vzorek příjemce lze použít bukální stěrku, vlasový kořínek nebo vzorky kožní biopsie. Vzorky bukálního stěru by měly být používány s opatrností, protože v bukálních vzorcích mohou být dárcovské buňky přítomny ve významném množství.
Dotaz: Jaké jsou možnosti použití vzorků dárce? Co když není k dispozici základní vzorek dárce?
Odpověď: Pokud je dárce naživu, získejte nový vzorek krve. Pokud dárce nežije, měly by se vzorky po transplantaci porovnat s výchozími vzorky pacienta před transplantací, aby se identifikovaly zjištěné alely STR, které nepocházejí od pacienta.
Dotaz: Jaké alely STR jsou zjištěny? Proč není HLA vhodným prostředkem pro sledování přihojení?
Odpověď: Proč není HLA vhodným prostředkem pro sledování přihojení? Dárci pro transplantaci jsou vybíráni tak, aby se co nejvíce shodovali s příjemcem. Neexistují žádné HLA markery, které by příjemce a dárce odlišovaly, pokud jsou shodní, a pouze jeden nebo dva, pokud jsou neshodní. Kromě toho jsou pro tento účel často citlivější jiné technologie než sledování neshodných alel HLA; proto se používají jiné lokusy, které poskytují jedinečné profily.
Dotaz: Co je to informativní STR lokus?
Odpověď: Co je to informativní STR lokus? Jedná se o lokus s alespoň jednou alelou jedinečnou pro příjemce nebo dárce. Aby byl lokus užitečný pro výpočet chimérismu, musí mít alely jedinečné pro oba. Pokud je k transplantaci použit nepříbuzný dárce, může existovat velký počet informativních lokusů, ale jen velmi málo, pokud je použit shodný sourozenec. Vzhledem k rozdílům v účinnosti amplifikace alel v jednotlivých lokusech je pro zvýšení přesnosti vhodnější získat průměrné nebo mediánové hodnoty z několika lokusů. Výsledky z jednotlivých lokusů jsou spolehlivě reprodukovatelné, takže pro trendování po sobě jdoucích vzorků lze použít i jeden lokus.
Dotaz: Co je to lokus „amelogenin“, který je součástí některých amplifikačních panelů?
Odpověď: Jaký je lokus „amelogenin“? Odpověď: Gen amelogenin se nachází na chromozomech X a Y. Nejedná se o STR, ale vykazuje různé velikosti produktů na příslušných chromozomech. Díky tomu je užitečný pro určení pohlaví. Je zahrnut do panelu primerů komerčních prodejců souprav zaměřených na komunitu forenzních lékařů, kde se rozlišování X/Y hojně využívá. Obecně se nepoužívá pro analýzu chimérismu, protože nemůže poskytnout jedinečný ženský marker (mužský vzorek vždy obsahuje alelu X); není užitečný ani při hodnocení vzorků po transplantaci kmenových buněk shodných s pohlavím.
Dotaz: Jak se liší analýza STR chimérismu od genotypizace?
Odpověď: „Genotyp“ označuje konkrétní alely přítomné v určitém lokusu. Genotypizace se provádí za účelem stanovení profilu příjemce a dárce při testování chimérismu. Při analýze chimérismu po transplantaci kmenových buněk se genotypové profily příjemce a dárce porovnávají s profilem vzorku po transplantaci, aby se vyhodnotilo, kolik je přítomno jednotlivých složek.
Genotypizace se používá i v jiných scénářích, například při soudním lékařství a testování rodičovství. Forenzní analytici používají genotypy k identifikaci zdroje důkazů v kriminálních případech a k vyloučení osob, které přicházejí v úvahu jako podezřelé. Mohou také identifikovat lidské ostatky v případech „John Doe“ a při hromadných neštěstích. Určování rodičovství se provádí podobným způsobem s cílem vyloučit někoho jako možného rodiče tím, že se u dítěte najdou přítomné alely, které se neshodují ani s matkou, ani s domnělým otcem.
Citovaná literatura/doporučená četba
Bryant E, Martin PJ. Dokumentace přihojení a charakterizace chimérismu po transplantaci krvetvorných buněk. In: Sborník příspěvků k problematice transplantace krvetvorných buněk: Forman S, Blune K, Thomas ED, eds. Hematopoietic cell transplantation. 2nd ed. Malden, MA: Blackwell Science, 1998.
Bultler J. Forensic DNA typing. Elsevier Academic Press.
.