Mapování úlohy MAP7 v kolaterálním větvení axonů

Neurony mají různorodou a charakteristickou dendritickou a axonální morfologii. Správný vývoj těchto struktur je nezbytný pro normální funkci a konektivitu. Abnormální morfologie neuronů je totiž spojena s různými neurobiologickými a psychiatrickými poruchami (Luo a O’Leary, 2005). Vývoj různých axonálních morfologií závisí na schopnosti rostoucích axonů reagovat na extracelulární podněty. Tyto signály vyvolávají lokalizovanou cytoskeletální přestavbu pro natáčení a větvení axonů (Armijo-Weingart a Gallo, 2017).

Vývoj axonů v senzorických neuronech DRG je vysoce stereotypní, a proto poskytuje dobrý model pro pochopení mechanismu větvení axonů. Tyto senzorické axony se při vstupu do míchy rozdvojují a dceřiné axony se prodlužují buď dopředu, nebo dozadu. Předně rostoucí axon stoupá vzhůru, aby přenesl smyslovou informaci určenou pro mozek. Kromě toho vzestupné a sestupné větve axonů vytvoří intersticiální axonové kolaterály, které se vytvoří z etablovaného axonového dříku, aby inervovaly různé lamely podél dorzálně-ventrální osy v míše (Gibson a Ma, 2011).

Nedávná práce Tymanskyj et al. (2017) se snažila identifikovat proteiny, které zprostředkovávají větvení axonů v senzorických neuronech DRG. Za tímto účelem porovnávali transkripční profily neuronů DRG před a po vytvoření kolaterálních větví. Protože protein 7 asociovaný s mikrotubuly (MAP7) byl po vytvoření kolaterál silně regulován, autoři dále zkoumali účinky nadměrné exprese a knockdownu MAP7 na primárních kulturách senzorických neuronů odebraných v časných a pozdních embryonálních stadiích. Nadměrná exprese MAP7 zvýšila počet intersticiálních větví u mladších neuronů, které obvykle MAP7 neexprimují. Naopak knokautace MAP7 u starších neuronů kultivovaných po vytvoření větví in vivo vedla k menšímu počtu intersticiálních větví in vitro. Tyto experimenty prokázaly, že MAP7 je dostatečný i nezbytný pro intersticiální větvení u senzorických neuronů.

Tymanskyj et al. (2017) uvažovali, že regulátor tvorby větví by se pravděpodobně lokalizoval do oblastí axonu, kde větve vznikají. Autoři skutečně zjistili silnou preferenci MAP7 v místech větvení. Protože vznikající větve vznikají z filopodií, které jsou stabilizovány průnikem mikrotubulů, načasování lokalizace MAP7 v bodech větvení by napovědělo o jeho roli, která řídí načasování a vzor tvorby větví. Autoři proto provedli živé zobrazování a zjistili, že fluorescenčně značený MAP7 chybí v pionýrských filopodiích, ale opožděně vstupuje do nových větví obohacených o mikrotubuly. Další práce zjistila, že MAP7 se přednostně lokalizuje v dlouhých a stabilních větvích. Tyto studie dohromady naznačují, že MAP7 je kritický pro zrání větví, ale pravděpodobně ne pro počáteční tvorbu větví.

Ačkoli tyto manipulace in vitro stanovily roli MAP7 v kolaterálním větvení, autoři se ji snažili doložit použitím myší mutanty, kde je protein MAP7 zkrácen na C terminusu (MAP7mshi) (Turner et al., 1997). Již dříve bylo prokázáno, že C terminus MAP7 interaguje s kinezinem (Sung et al., 2008; Barlan et al., 2013). Tymanskyj et al. (2017) tedy usoudili, že se jedná o mechanismus větvení axonů a MAP7mshi neurony budou mít méně kolaterál. Překvapivě, senzorické neurony kultivované z myší MAP7mshi měly drastický nárůst větvení axonů ve srovnání s neurony z kontrolních zvířat. To v kombinaci s dřívějšími zjištěními in vitro silně naznačuje, že pro podporu kolaterálního větvení axonů je zásadní N-konec, a nikoli C-konec MAP7. Je zajímavé, že pokud by C terminus nebyl nutný pro podporu větvení, pak by bylo rozumné předpokládat, že neurony MAP7mshi budou podobné kontrolním neuronům; místo toho však ztráta C terminusu MAP7 vede k zesílení kolaterálního větvení. Jedním z vysvětlení je, že C-koncová doména blokuje N-koncovou funkci a ztráta C-konce vede k bujnému větvení. Je také možné, že C-terminální zkrácení vytváří u mutantních myší abnormálně vysoké hladiny proteinu MAP7 podporující větvení axonů podobně jako nadměrná exprese MAP7 in vitro. Ačkoli Tymanskyj et al. (2017) pomocí in situ analýzy a RT-PCR potvrdili přítomnost zkrácené mRNA u zvířat MAP7mshi, srovnatelné hladiny exprese MAP7 jsou nejasné. Přesná regulační role C-konce bude tedy vyžadovat další studium.

Klíčový objev u zvířat MAP7mshi přinesla analýza projekcí senzorických neuronů DRG. Pro přesnou citlivost na vnější podněty musí senzorické neurony správně inervovat jak periferní cílovou tkáň, jako je kůže a sval, tak míchu vytvořením řady axonových kolaterál v obou oblastech. Je zajímavé, že myši MAP7mshi vykazovaly zvýšený počet axonových kolaterál větvících se do míchy ve srovnání s kontrolními zvířaty, zatímco počet kolaterál v přední tlapce byl normální. Aberantní inervace axonů DRG míchou u myší MAP7mshi byla spojena s tepelnou hyperalgezií, což naznačuje, že nociceptory DRG závisí na MAP7 pro správnou tvorbu axonů. Je třeba dále zkoumat, zda MAP7 vyžadují i další podtypy neuronů DRG. Ačkoli Tymanskyj et al. (2017) kultivovali heterogenní populaci senzorických neuronů z disociovaných DRG, doplňovali tyto kultury nervovým růstovým faktorem (NGF), který poskytuje trofický faktor pouze pro podskupinu neuronálních subtypů (tj. nociceptorů) (Lallemend a Ernfors, 2012). Ostatní podtypy neuronů DRG (např. proprioceptory) nezískávají trofickou podporu od NGF, a proto byly z těchto kultur vyloučeny (Lallemend a Ernfors, 2012). Zda nociceptory i proprioceptory spoléhají na MAP7, je obzvláště zajímavé, protože se promítají do různých cílů. Pozoruhodné však je, že Tymanskyj et al (2017) zjistili, že (1) pouze podmnožina větví vycházela z oblasti obohacené o MAP7, (2) pouze podmnožina oblastí obohacených o MAP7 podél axonu vytvářela větve a (3) MAP7mshi myši měly abnormality větvení v centrálních, ale ne v periferních projekcích. Je tedy pravděpodobné, že tvorbu větví v těchto axonech řídí jiné faktory.

Rozsáhlá práce ukázala, že environmentální podněty formují tvorbu větví axonu tím, že spouštějí vysoce regulovanou sekvenci cytoskeletálních událostí, včetně tvorby aktinových políček, vzniku filopodů a polymerizace a depolymerizace mikrotubulů (Armijo-Weingart a Gallo, 2017). Proteiny asociované s mikrotubuly (MAP) mohou zprostředkovávat změny cytoskeletu tím, že pozitivně nebo negativně ovlivňují stabilitu a svazování mikrotubulů (Armijo-Weingart a Gallo, 2017). Podobně jako nová role MAP7 při zrání smyslových větví byla v předchozích pracích identifikována role MAP7 ve stabilitě mikrotubulů Sertoliho buněk a spermatogenezi, kdy absence MAP7 u myší vede ke sterilitě samců (Komada et al., 2000; Magnan et al., 2009). Naopak Tymanskyj a další (Tymanskyj et al., 2012; Barnat et al., 2016) identifikovali MAP1B jako negativní regulátor větvení a zrání axonů v kortikálních a dospělých DRG neuronech. Tyto práce vrhají světlo na rozmanitý soubor proteinových nástrojů, které mají programy vnitřního zrání větví k dispozici. Zajímavou otázkou je, co řídí soutěž mezi pozitivními a negativními regulátory o zprostředkování výstavby nebo destrukce větví.

Lokálně segregované větve z jednoho neuronu mohou reagovat na permisivní a/nebo restriktivní podněty. Jak bylo uvedeno výše, Tymanskyj et al. (2017) zjistili, že myši MAP7mshi mají aberantní kolaterální větvení v míše, ale ne v přední tlapce, což naznačuje, že tyto divergentní větve reagují na různé environmentální signály. Toto zjevné omezení funkce MAP7 na centrální, ale nikoli periferní kolaterální větvení odráží jednostrannou funkci SAD kináz v centrální, ale nikoli periferní inervaci u proprioceptivních neuronů, dalšího podtypu senzorických neuronů (Lilley et al., 2013). Lilley et al. (2013) navrhují model, ve kterém SAD kinázy modelují axonální arbors prostřednictvím sekvenčního dlouhodobého a krátkodobého působení neurotrofinů. Proprioceptivní neurony dostávají tonickou dlouhodobou expozici neurotrofinu-3 z periferních cílů, jako je sval, což vede k upregulaci exprese SAD kináz. Tato upregulace připravuje axony k vlastnímu programování větvení, ale tato připravená dráha je spuštěna až po krátkodobé expozici neurotrofinu-3 z cílových neuronů v míše, jako jsou motorické neurony, aby vyvolala hojné větvení ve ventrální míše (Lilley et al., 2013). Naproti tomu vzorování axonů u jiných podtypů neuronů může být řízeno různými extracelulárními podněty. Například sympatický nervový systém, další populace závislá na neurotrofinech, reaguje na dva různé neurotrofické podněty v postupných krocích během axonální projekce. Sympatické axony zpočátku rostou podél krevních cév, což je mezilehlý cíl, který vylučuje neurotrofin podporující prodloužení axonu (Kuruvilla et al., 2004). Při konečné inervaci jsou však terminály axonů vystaveny působení NGF, který je produkován cílovou tkání. NGF produkovaný cílovou tkání indukuje signální přepínač, který zastaví růst axonu a podpoří větvení, aby umožnil rozsáhlou inervaci cíle (Suo et al., 2015). Možná, že zrání větví závislé na MAP7 také závisí buď na (1) jediném axonovém vzoru s časově a místně odlišnými vzory, nebo na (2) různých sekvenčních signálech z mezilehlých a konečných cílů.

Neurologické poruchy mohou být spojeny se změněným chováním axonů a mozkovou konektivitou, což přispívá k jejich komplexní a multifaktoriální povaze. Zajímavé je, že MAP7 je exprimován v embryonálních myších mozcích a studie jemného genetického mapování ukazují významnou asociaci u jednonukleotidových polymorfismů MAP7 se schizofrenií (Fabre-Jonca et al., 1998; Torri et al., 2010; Venkatasubramanian, 2015). V návaznosti na objevy Tymanskyj et al. (2017) v periferním nervovém systému bude pro objasnění případné souvislosti mezi MAP7 a schizofrenií zásadní prozkoumat regulaci MAP7 při zrání axonálních větví v mozku. Kromě toho je mimo vývoj periferního nervového systému vyžadováno kolaterální větvení axonů v celém nervovém systému, které je rozhodující pro správné zapojení. Předchozí studie naznačují, že aktivace vnitřních buněčných programů, které podporují polymerizaci mikrotubulů, může pozitivně regulovat opětovný růst a větvení axonů po poranění (Ruschel et al., 2015). Proto, abychom rozeznali potenciální terapeutické cíle pro opětovný růst axonů, se budoucí výzkumy mohou zaměřit na MAP7, aby se znovu zapojilo vnitřní vývojové programování.

.