4.3 Od čočkového váčku ke zralé čočce
Čočkový váček vzniká uzavřením čočkového pohárku (známého také jako čočková jamka) a oddělením od povrchového ektodermu. Mezistupněm je vývoj stopky čočky, která drží uzavřený měchýřek a povrchový ektoderm po několik hodin pohromadě (u myši). Čočkový váček je téměř kulovitý s velkou centrální dutinou; buňky z jeho zadního pólu se prodlužují, až dosáhnou předních epitelových buněk a vyplní celý čočkový váček; tyto prodloužené buňky se označují jako primární buňky čočkových vláken. K tomuto kroku dochází kolem 44. dne těhotenství u lidských embryí a v E11,5 u myší (obr. 10.5). Buňky na předním pólu vezikulu čočky zůstávají jako epitelové buňky. Mitoticky aktivní buňky obklopující centrální oblast epitelu čočky se přesouvají do ekvatoriální oblasti (neboli oblasti laloku čočky), kde se prodlužují a diferencují v sekundární vlákna čočky. Střední linie, kde se spojují sekundární vlákna čočky z opačných bodů rovníku, se označuje jako přední a zadní šev čočky. Sekundární vlákna čočky tvoří soustředné vrstvy kolem primárních vláken jádra čočky (u myši v den E15,5; obr. 10.5). Při tomto uspořádání jsou vlákna čočky směrem k periferii postupně mladší z hlediska vývoje a diferenciace. Dokud čočka roste, nová sekundární vlákna se přesouvají od rovníku na vnější kůru čočky.
Obrázek 10.5. Formování čočky. Po vytvoření čočkového váčku se primární čočková vlákna prodlužují ze zadního epitelu čočkového váčku a vyplňují celý jeho lumen. Sekundární vlákna se začínají prodlužovat v oblasti laloku čočky; vlákna z opačných stran se setkávají na předním a zadním pólu a dávají vzniknout čočkovým švům (které mají v trojrozměrném zobrazení tvar písmene Y). Posledním krokem diferenciace čočky je degradace buněčných jader a mitochondrií, která u myši probíhá přibližně v době narození (upraveno podle Graw, 2003; se souhlasem Nature Publishing Group).
Buňky primárních i sekundárních vláken ztrácejí své mitochondrie a buněčná jádra během závěrečného procesu diferenciace: u primárních vláken probíhá u myší v E17/E18 a je dokončena 2 týdny po narození, kdy myši otevřou oční víčka (Vrensen et al., 1991). Buňky sekundárních vláken, které obklopují buňky primárních vláken, ztrácejí své organely, když se přesouvají z vnější do vnitřní kůry (Kuwabara a Imaizumi, 1974).
Buňky předního epitelu však zůstávají mitoticky aktivní jako nika kmenových buněk produkujících buňky sekundárních vláken. Tyto sekundární vláknité buňky čočky jsou terminálně diferencované buňky a ztrácejí také své organely, když jsou zatlačeny hlouběji do čočky následnými vláknitými buňkami.
U zebřiček však dochází k několika rozdílům ve vývoji a diferenciaci čočky. Zejména prodlužování primárních vláknitých buněk probíhá kruhovým způsobem, jehož výsledkem je embryonální jádro čočky se soustřednými schránkami vláken. Velmi těsné rozestupy jader diferencujících se sekundárních vláken v úzké zóně v blízkosti rovníkového epitelu však naznačují, že diferenciace sekundárních vláknitých buněk se odchyluje od diferenciace popsané u savčích nebo ptačích čoček. Vzhledem k těmto rozdílům je třeba být opatrný při extrapolaci poznatků o zebřičkách na vývoj nebo funkci myší nebo lidské čočky (Dahm et al., 2007).
U myší charakterizují význam přechodné povahy stadia stopky čočky nejméně dva geny, Pitx3 a Foxe3. U myších embryí je Pitx3 exprimován ve vyvíjející se čočce od E11, nejprve ve vezikulu čočky a později v předním epitelu a rovníku čočky. Bylo prokázáno, že mutace v regulačních nebo kódujících oblastech genu Pitx3 způsobují fenotyp afakických (ak) nebo bezokých (eyl) myších mutantů, kterým chybí čočka a zornice (Rieger et al., 2001; Rosemann et al., 2010; Semina et al., 2000). U těchto myší přetrvává stopka čočky několik dní, což nakonec vede k degradaci rudimentárního vezikulu čočky, a celou oční kouli vyplňuje sítnicová tkáň. Vzhledem k tomu, že Pitx3 je exprimován také v dopaminergních neuronech substantia nigra, jsou tyto myši také vynikajícími modely Parkinsonovy choroby (Rosemann et al., 2010). Na rozdíl od myší způsobují mutace v lidském PITX3 mezenchymální dysgenezi předního segmentu (ASMD; Semina et al., 1998).
Myši ak/ak mají oční fenotyp velmi podobný myším dyl (dysgenická čočka), což naznačuje, že oba geny jsou zapojeny do stejného biologického procesu. Blixt et al. (2000) ukázali, že fenotyp dyl je zprostředkován mutací v genu Foxe3. U myší je FoxE3 exprimován ve vyvíjejícím se oku kolem E9,5, na začátku indukce plaku čočky (obr. 10.2). Při formování plaku čočky se exprese FoxE3 zvyšuje a omezuje se na vezikuly čočky, které se oddělují od povrchového ektodermu. U myší dyl byly identifikovány dvě mutace v DNA vazebné doméně FoxE3. U lidí jsou mutace v genu FOXE3 zodpovědné za optickou dysgenezi předního segmentu (ASOD). Vzhledem ke způsobu exprese FOXE3 a variabilnímu fenotypu heterozygotních dyl myší byla na přítomnost mutací FOXE3 vyšetřena malá skupina pacientů s Petersovou anomálií, u nichž nebylo možné detekovat mutace PAX6. Ukázalo se, že jeden z pacientů je heterozygotem pro záměnu Arg90Leu, která ovlivňuje DNA-vazebnou doménu FOXE3 (Ormestad et al., 2002).
Druhým důležitým krokem je prodlužování buněk v zadní polovině čočkového vaku, které jej vyplňují buňkami primárních vláken. U myšího mutanta „neprůhledné skvrny v čočce“ postihuje bodová mutace základní oblast Maf (kódovanou onkogenem, který je zodpovědný za muskuloaponeurotický fibrosarkom) a zabraňuje správné tvorbě primárních vláken čočky, což vede k fenotypu, který je podobný prachové kataraktě u lidské rodiny (Lyon et al., 2003). Savčí MAF je exprimován v plaku čočky a vezikulu čočky a později v primárních vláknech čočky.
Podobně Puk et al. (2008) nedávno charakterizovali nového myšího mutanta vyvolaného ethylnitroso-ureou (ENU) s fenotypem malého oka a prázdným vezikulem čočky v homozygotním stavu. V tomto případě byla identifikována mutace v genu Gjf1 (označovaném také jako Gje1). Gen Gjf1 u myší kóduje protein podobný konexinu o velikosti 23,8 kDa, který je exprimován v zadní části vezikulu čočky, kde začíná prodlužování primárních vláken. U mutantů je změněn vzorec exprese Pax6, Prox1, Six3 a Crygd, nikoli však vzorec exprese Pax2. Předpokládá se, že gen Gjf1 je nezbytný pro tvorbu primárních vláken čočky (Puk et al., 2008) a mohl by být považován za následný cíl transkripčního faktoru c-Maf; mutace v odpovídajícím genu Maf vedou u myší k podobnému fenotypu (Lyon et al., 2003; Perveen et al., 2007). V současné době není jasné, zda existuje funkční lidský protějšek myšího genu Gjf1.
Třetí fenotyp bez prodloužení primárních vláken čočky je způsoben vyřazením genu Pparbp (kódujícího protein vázající receptor peroxizomového proliferátorového aktivátoru; Crawford et al., 2002). Vztah mezi těmito třemi funkčně odlišnými proteiny pro tvorbu buněk primárních vláken čočky není zatím jasný.
Kromě těchto tří genů může při prodlužování buněk primárních vláken hrát roli také signalizace Wnt. Faber a spol. v roce 2002 popsali dominantně negativní formu Bmp-receptoru 1b (genový symbol: Bmpr1b) u transgenních myší. Tito transgenní myší mutanti vykazují inhibici vývoje primárních vláknitých buněk, avšak asymetricky: objevila se pouze na nazální straně čočky ve ventrální polovině. Autoři dospěli k závěru, že v různých kvadrantech mohou působit odlišné diferenciační podněty.
Na přední straně zůstávají epitelové buňky čočky jedinými mitoticky aktivními buňkami čočky. Jsou charakterizovány probíhající expresí několika genů Wnt: uváděné podrobné údaje o expresi se však liší nejen mezi kuřaty a myšmi, ale liší se i mezi různými kmeny myší (podrobnosti viz přehled de Iongh et al., 2006). Nicméně zůstává jasné, že geny signální dráhy Wnt jsou exprimovány převážně v epiteliálních buňkách čočky. Důsledně byla prokázána také exprese receptorů Fzd (genové symboly: Fzd1-8) a ko-receptorů Lrp5 a Lrp6, genů Sfrp1-3 a Dkk1-3 během vývoje čočky. Jsou přítomny především v epiteliálních buňkách; jedinou výjimkou je Fzd6, který je stále více exprimován v diferencujících se vláknitých buňkách (de Iongh et al., 2006). Jako příklad byly analyzovány nulové mutanty lrp6, které vykazují (kromě některých dalších defektů; viz databáze MGI) malé oči a aberantní čočky charakterizované neúplně vytvořeným předním epitelem, což má za následek extruzi vláken čočky do nadložního rohovkového stromatu (Stump et al., 2003).
Klíčovým spouštěčem diferenciace buněk vláken čočky je však signalizace Fgf. Jeden z nejvýznamnějších nálezů prokázal na explantátech čočky potkana, že různé koncentrace Fgf2 (dříve známého jako „basic Fgf“ nebo „bFGF“) jsou zodpovědné za proliferaci, migraci a diferenciaci buněk čočkových vláken (McAvoy a Chamberlain, 1989). Jelikož stále není známo, který z několika Fgf se podílí na indukci čočky (Smith et al., 2010), výzkum se zaměřil na receptory Fgf. Jak bylo uvedeno výše, u čoček, kterým chyběly tři geny pro receptory Fgf (Fgfr1-3; Zhao et al., 2008), došlo k závažným defektům v prodlužování buněk čočkových vláken. Fgf signalizace je také nezbytná pro priming nekanonické Wnt dráhy (tj, nezávislou na β-kateninu) v epiteliálních buňkách čočky; v explantátech čočky vede k akumulaci β-krystalinu, markeru diferenciace vláknitých buněk (Lyo a Joo, 2004).
Zralá čočka obsahuje několik tříd strukturálních proteinů: krystaliny (α-, β-, γ-, δ-, μ-, ζ-krystaliny), transmembránové proteiny (jako MP19 a MIP26 a konexiny 43, 46 a 50), některé kolageny a cytoskeletální a intermediární filamentární proteiny. Mutace v příslušných genech (nebo specifických transkripčních faktorech) vedou k funkční nerovnováze a zákalům čočky (katarakta). Věk nástupu katarakty a způsob dědičnosti závisí na expresi příslušných genů a na doméně, která je postižena základní mutací. Celkem je známo ∼60 různých genů, které jsou zodpovědné za vznik katarakty u myší a lidí. Podrobné pojednání o příslušných mutacích a jejich funkčních důsledcích přesahuje rámec této kapitoly; přehledy odpovídající tomuto konkrétnímu tématu publikoval autor nedávno (Graw, 2009a,b).
.