12. května 2018
Jednou z častých otázek, kterou si vědci kladou vždy, když dostanou signál z testu založeného na protilátkách, je: „Představuje tento signál skutečně přítomnost a množství mého proteinu?“
Specifičnost protilátky je pro vědce vždy problémem. Přestože existuje řada validačních metod, které byly použity pro testování specifičnosti, data jsou často nadměrně interpretována. Výzkumné údaje různých skupin ukázaly, že některé široce používané monoklonální protilátky na trhu ve skutečnosti nejsou monospecifické. Mohou zkříženě reagovat s jinými proteiny.A zkřížená reaktivita může výzkumníky uvést v omyl falešně pozitivními výsledky a potenciálně způsobit neočekávané vedlejší účinky a falešná diagnostická hlášení pro klinické lékaře.
Jaké kontroly bychom tedy měli použít pro validaci specifity protilátek?
Buněčné linie a tkáně, které exprimují cílové proteiny ve vysokém množství, lze použít jako pozitivní kontroly pro validaci protilátek.Může se jednat o endogenní protein nebo o exprimovaný protein kódovaný klonem cDNA. Pozitivní kontrola však není schopna potvrdit specifičnost protilátky. Můžete vidět proužek správné velikosti nebo pozitivní zbarvení ve správném subcelulárním umístění, ale to vše mohou být falešně pozitivní signály ze zkřížené reaktivity protilátky. Proto je obvykle pro validaci protilátek vyžadována negativníkontrola pro posouzení nespecifické vazby.
Validace knockoutem je zatím nejlepší negativní kontrolou pro posouzení specifity protilátek. Při knockout validaci se protilátka testuje na knockoutované buněčné linii, která neexprimuje cílový protein. Od roku 2017 se společnost OriGene spojila s firmou EdiGene, inovátorem CRISPR, aby vysoce výkonným způsobem produkovala buňky s dvojitým knockoutem. Na rozdíl od knockoutové buněčné linie od společnosti Horizon pocházejí knockoutové buněčné linie společnosti OriGene z běžně používaných buněčných linií, jako jsou HEK293T nebo HeLa, což činí produkt relevantnějším pro výzkumné pracovníky.V této dvojité knockoutové buněčné linii není cílová protilátka přítomna, protože gen kódující protein je eliminován nebo „vyřazen“. Vzorky z knockoutovaných buněk a rodičovských buněk (divoký typ) jsou testovány vedle sebe proti stejné protilátce, a pokud je protilátka skutečně specifická, měla by detekovat specifický signál pouze v buňce divokého typu, ale ne v knockoutované buněčné linii. Pomocí lyzátů z těchto knockoutovaných buněk jsme validovali více než 100 monoklonálních protilátek (KO validované protilátky). Předpokládá se, že validace knockoutů nabízí skutečnou negativní kontrolu pro testování specifičnosti protilátek.
Ale stačí validace knockoutů k potvrzení monospecifičnosti protilátky? Tento závěr bych bral s rezervou. za prvé, off target účinky knockoutovaných buněk nejsou v této fázi dobře prozkoumány. Mohlo by se tedy stát, že knockoutovaná buňka nejen eliminuje expresi proteinu, který vás zajímá, ale také eliminuje nebo sníží expresi jiného proteinu, který může být proteinem zkříženě reagujícím s protilátkou. Negativní signál tedy nemusí vždy znamenat, že protilátka nebude reagovat s žádným jiným proteinem kromě proteinu, který vás zajímá. Za druhé, testování s knockoutovanou buňkou/tkání je možné pouze pro neesenciální proteiny. U esenciálních proteinů je knockout nemožný. Pro tyto proteiny tedy budete potřebovatjiný způsob testování specifičnosti protilátky.
Před několika lety vyvinula společnost OriGene metodu proteinového pole pro testování specifičnosti protilátek. Díky největší světové sbírce lyzátů z nadměrné exprese jsme vytvořili jedinečný proteinový čip, který obsahuje >10 000 nadměrně exprimovaných lidských proteinů v duplikátu na jediném skleněném sklíčku potaženém nitrocelulózou. Tato technologie proteinového mikročipu byla použita k ověření specifity mnoha monoklonálních protilátek OriGeneUltraMAB™. Zvýšením počtu proteinů na čipu lze dále studovat zkříženou reaktivitu protilátky v celém lidském proteasomu.
Shrnem lze říci, že testování specifity protilátek je poměrně složité. Je třeba jej validovat pomocí více nástrojů a směrů. s dalším technologickým pokrokem budeme mít k dispozici cennější prostředky a standardizované postupy pro validaci protilátek. vědci nebudou čelit stejným otázkám, když dostanou pozitivní signály ze svých testů založených na protilátkách.
.