Oxid chromitý (51Cr2O3 ) použitý jako biologický marker nebyl rybami absorbován

VÝSLEDKY A DISKUSE

Parametry kvality vody – teplota (28.08±0,01mg.L-1) a dusičnanový dusík (1,19±0,06mg.L-1) – byly považovány za vhodné z hlediska welfare ryb a přirozeného vývoje (Boyd, 1990).

Oxid chromitý je nejrozšířenějším inertním markerem ve výživových studiích se zvířaty a krmiva umožňují jeho hodnocení a přesné sestavení vyvážených diet. Úplná výtěžnost Cr3+ ve formě oxidu byla potvrzena pomocí radioaktivní izotopové techniky (Kane et al., 1959) a z tohoto důvodu byl v této studii použit jako 51Cr2O3 (čistota 99,99 %).

51Cr byl v této studii použit, aby se předešlo možným chybám způsobeným zpětným získáváním chromu v krmivech, akvarijní vodě, trusu a vzorcích tkání ryb, protože umožňuje přímé, jednoduché, citlivé a přesnější, prvkové odečtení ve vzorkovém materiálu, což snižuje zkreslení spojené s chemickou analýzou, zejména ve studiích stravitelnosti a výživy. Všechny tyto faktory byly v této studii pečlivě sledovány a kontrolovány, aby výsledky mohly být připsány výhradně účinkům léčby. Tabulka 2 ukazuje výsledky, směrodatnou odchylku a regresní parametry stanovené po logaritmické transformaci specifických aktivit 51Cr zjištěných ve vzorcích odebraných z kontrolních a pokusných ryb v závislosti na čase (dnech) odběru. Regrese byly porovnány pomocí úhlových a lineárních koeficientů (Ostle a Mensing, 1975).

Pro zjištění, zda dochází k absorpci chromu III v rybách, jako je oxid chromitý, byly upraveny jednoduché lineární regrese – dny odběru vs. koeficienty stanovení pro vzorky kontrolních a pokusných ryb (obr. 1). Hodnoty pozadí naměřené u vzorků tkáně ryb, které nedostávaly experimentální stravu, 10 000 počtů v pěti intervalech, činily v průměru 98,02±3,61cpm a byly odečteny od všech naměřených hodnot ze vzorků kontrolních a experimentálních ryb.

Střevní absorpce trojmocného chromu (např. chloridů, fluoridů, fosforečnanů, dusičnanů a hydroxidů) je u lidí i zvířat nízká a pohybuje se přibližně mezi 0,5 a 2,0 % v závislosti na příjmu potravy. Některé údaje naznačují, že absorpce chromu je nepřímo úměrná jeho příjmu v potravě (Anderson a Kozlovsky, 1985). V tomto pokusu byla hladina oxidu chromitého přidaného do diety pouze 0,01 % a podle výše uvedených autorů by při této malé míře chromu docházelo ke zvýšené absorpci trávicím traktem, a proto by byl snáze detekován ve vzorcích pokusných ryb.

Přizpůsobené regrese pro vzorky krve ryb krmených kontrolní dietou po dobu sedmi dnů, kontrolní zvířata, se při porovnání s regresí přizpůsobenou vzorkům ryb krmených pokusnou dietou mezi sebou nelišily (P>0,05). Tyto výsledky se shodují s výsledky, které získali Utley et al. (1970), kteří rovněž použili radioaktivní oxid chromitý (III) orálně, ale podávaný skotu, a radiaci v krvi jalovic nezjistili. Jiné studie uvádějí rychlý průchod 51CrCl3 gastrointestinálním traktem (Oberleas a Stoecker, 1987) a rychlé vrcholy 51Cr v krvi (Hopkins mladší, 1965) potkanů a hladiny v krvi odrážejí příjem chromu (III). Pokud by tedy oxidy chromu trpěly absorpcí gastrointestinálním traktem, musela by být jejich přítomnost v krvi ryb v této studii rychle zjištěna.

V krvi je absorbovaný chrom (III) vázán především na transferin a na další bílkoviny, které jsou zodpovědné za jeho transport v těle. K dlouhodobému ukládání dochází zejména v játrech, slezině, kostech a dalších orgánech (Lim et al., 1983). Modely akumulace chromu jsou v následujícím pořadí: ledviny > játra > žábry H“ svalovina, pro nižší koncentrace (Palaniappan a Karthikeyan, 2009).

Pokud byl tilapií nilskou absorbován chrom ve formě inertního markeru, tento minerál se hromadí v tkáních ryb. Proto, aby se zjistilo, zda došlo k absorpci chromu jako markeru, přes trávicí trakt tilapie nilské, byly vzorky krve porovnány s upravenou regresí z kontrolních ryb, s regresí upravenými vzorky viscerálního tuku, jaterní tkáně, svalové tkáně a ledvinové tkáně ryb, které dostávaly experimentální dietu a ty se mezi sebou nelišily (P>0,05), a tak jsou charakterizovány jako patřící do jedné lineární regrese. Tyto výsledky naznačují, že ve vzorcích pokusných ryb nebyla zjištěna žádná radioaktivita, což naznačuje, že nedošlo k významnému vstřebávání tohoto markeru.

Mechanismus zodpovědný za střevní absorpci chromu není dobře znám. Není jasné, zda se Cr vstřebává pasivně nebo pomocí přenašečových proteinů umístěných ve střevní sliznici. Mertz et al. (1965) repostovali, že absorpce trojmocného Cr se nezdá být saturovatelným procesem, což naznačuje, že je absorbován pasivní difuzí. Mertz a Roginski (1971) uvádějí opačné důkazy. Zjistili, že procento trojmocného chrómu absorbovaného everted střevními vaky klesá se zvyšující se koncentrací Cr v inkubačním médiu. Tento pozorovaný saturační efekt naznačuje, že se na absorpci Cr podílejí přenašečové proteiny. V pokusu Dowlinga a spol. (1989) však byl učiněn závěr, že anorganický trojmocný chrom je absorbován nezprostředkovaným procesem pasivní difúze v tenkém střevě potkanů krmených stravou s dostatkem Cr.

Podle výsledků získaných Febelem a spol. (2001) bylo během hodiny absorbováno 2,5 % oxidu chromitého a absorbovaný chrom byl přenesen do jater, kde jaterní tkáň zadržovala 10,9 % oxidu chromitého. Tyto výsledky se liší od výsledků této studie, domníváme se, že je to proto, že nedošlo k významnému zvýšení obsahu chromu 51Cr v analyzovaných tkáních ryb: krvi, viscerálním tuku, játrech, ledvinách a souboru ryb, což nenasvědčuje absorpci a následné bioakumulaci markeru. To, co se v jednotlivých pokusech lišilo, byl systém použitý k udržení správných podmínek pro život ryb v akváriu, koncentrace markeru přidávaného do krmiva a druh ryb.

Jedním z možných vysvětlení je, že oxid chromitý není inertní marker a že dochází ke značné absorpci chromu ve formě oxidu chromitého nebo jiných derivátů chromu vznikajících při trávení přes střevní stěnu (Fernandez et al., 1999). Dalším vysvětlením, které navrhli Ng a Wilson (1997) k vysvětlení výsledků Shiau a Lianga (1995), je možná inkorporace chromu přítomného v akvarijní vodě žábrami ryb v důsledku vyprazdňování výkalů ryb obsahujících chrom do akvarijní vody. I při účinné obměně akvarijní vody se koncentrace chromu zvyšuje, což vede k absorpci minerálů (Fernandez a kol., 1999).

V tomto pokusu se statickým systémem byla každodenní akvária odsávána, aby se snížila rezidua a zabránilo se hromadění krmiva a výkalů ve vodě, a obnovovala se pouze voda ztracená odpařováním a hospodařením. Tento postup způsobil lineární nárůst koncentrace chromu a vodivosti tohoto minerálu v akvarijní vodě a ve vzorcích žaber. Akumulace se mění v závislosti na době expozice a koncentraci v prostředí. Při nízké koncentraci byla akumulace v souladu s dobou expozice (Palaniappan a Karthikeyan, 2009).

Těžké kovy (např. kobalt, měď, mangan, molybden, zinek a chrom) ve vodním prostředí jsou kritickým problémem kvůli jejich akumulaci ve vodních organismech (Dimari et al., 2008). Ryby, které jsou hlavními složkami většiny vodních biotopů, jsou rovněž považovány za dobré bioakumulátory anorganických minerálů (King a Jonathan, 2003). Žábry jsou rovněž uváděny jako důležité místo pro vstup těžkých kovů, což vyvolává jejich poškození a léze (Bols et al., 2001). Pro další ověření této hypotézy byla v tomto pokusu koncentrace 51Cr2O3 dodávaná v potravě pokusných ryb 100 µg.g-1 se specifickou aktivitou 58,2 µCi. Pokud by tedy byl prvek absorbován trávicím traktem ryb, případně inkorporací přes žábry přítomné v akvarijní vodě nebo jinou cestou, mělo by být u tilapií nilských zjištěno přinejmenším gama záření pocházející z poklesu 51Cr.

Při nastavení regresí byly vzorky krve odebrané kontrolním rybám konfrontovány s těmi, které představovaly výsledky odebraných vzorků střeva bez obsahu, žaludku bez obsahu, obsahu trávicího traktu ryb, které dostávaly experimentální stravu, a byl zjištěn lineární nárůst a významné rozdíly mezi stanovenými regresemi (P<0,05). Tyto získané výsledky naznačují, že střevo bez obsahu, žaludek bez obsahu a obsah trávicího traktu měly během sedmidenního experimentálního období nasycovací účinek.

Výsledky získané Clawsonem a dalšími (1955) naznačují, že koncentrace oxidu chromitého ve výkalech se dostává do rovnováhy s koncentrací zkonzumovaného krmiva mezi třemi a čtyřmi dny po prvním zkrmení této sloučeniny. V této studii však byla až do sedmého dne zvýšená koncentrace markeru ve výkalech, tento rozdíl může být způsoben nízkou koncentrací markeru použitého v tomto pokusu a nezbytným nasycením trávicího traktu.

S ohledem na výsledky získané v této studii souhlasíme s Fernandezem et al. (1999), že dalším možným vysvětlením výsledků získaných Shiauem a Liangem (1995) a Shiauem a Shyem (1998) by bylo, že obsah chromu v rybách se řídí stejnou zákonitostí, jakou zjistili u jiných anorganických živin (vápník, fosforečnany, popeloviny), zvyšuje se jeho koncentrace u ryb krmených dietami doplněnými oxidem chromovým, s maximem při hladině oxidu chromového kolem 5-10 g.kg-1 . Toto zvýšení by mohlo souviset spíše s vyšší retencí přirozeného chromu přítomného v potravě než s absorpcí doplněného oxidu chromitého. Bylo zjištěno (Evtushenko a kol., 1986), že hladina akumulovaných kovů v tkáních zůstávala vždy na úrovni plató, i když jim byly organismy vystaveny nepřetržitě po dostatečně dlouhou dobu.

Navíc hladiny markeru (5 až 10 % oxidu chromitého inkorporovaného do stravy) použité v těchto studiích, dokonce i při vysokém stupni čistoty, mohou poskytovat jiné formy komplexace chromu, které mohou být rybami absorbovány trávicím traktem nebo jinými cestami.