4.3. Struktura nikotinového receptoru
Nikotinový receptor elektrického orgánu a kosterního svalu obratlovců je pentamer složený ze čtyř různých podjednotek (a, b, g a d) ve stechiometrickém poměru 2:1:1:1, resp. Ve zralých, inervovaných koncových svalových ploténkách je podjednotka g nahrazena podjednotkou e, která je blízce příbuzná. Jednotlivé podjednotky jsou přibližně ze 40 % identické ve svých aminokyselinových sekvencích, které vznikly ze společného prapůvodního genu. Nikotinový receptor se stal prototypem pro další pentamerické ligandem řízené iontové kanály, mezi něž patří receptory pro inhibiční aminokyseliny (g-aminomáselná kyselina a glycin) a některé serotoninové receptory (5-HT3). Každá z podjednotek pentamerického receptoru má molekulovou hmotnost 40 000 až 60 000 daltonů. Amino-terminálních 210 zbytků tvoří prakticky celou extracelulární doménu. Následují čtyři transmembránové domény (TM); oblast mezi třetí a čtvrtou doménou tvoří většinu cytoplazmatické složky. Každá z podjednotek v rámci nikotinového ACh receptoru má extracelulární a intracelulární expozici na postsynaptické membráně. Pět podjednotek je uspořádáno kolem pseudoosy symetrie, která ohraničuje vnitřně umístěný kanál,
Receptor je asymetrická molekula (14 nm × 8 nm) o velikosti 250 000 daltonů, přičemž většina nemembránových domén se nachází na extracelulárním povrchu. V junkčních oblastech (tj. motorická koncová destička kosterního svalu a ventrální povrch elektrického orgánu) je receptor přítomen ve vysoké hustotě (10 000/mm2) v pravidelném uspořádání. Toto uspořádání receptorů umožnilo rekonstrukci jeho molekulární struktury pomocí elektronového mikroskopického obrazu. U sladkovodních i mořských plžů byl identifikován protein vázající ACh, který je homologní pouze s extracelulární doménou nikotinového receptoru a byl charakterizován strukturně i farmakologicky.
Tento protein se sestavuje jako homomerní pentamer a váže ligandy nikotinového receptoru s očekávanou selektivitou; jeho krystalová struktura odhaluje atomární uspořádání očekávané od nikotinového receptoru. Sloučením ACh-vázajícího proteinu a transmembránových rozpětí receptoru navíc vzniká funkční protein, který vykazuje kanálové hradlo a změny stavu očekávané od receptoru. Tento vazebný protein slouží jako strukturní i funkční náhražka receptoru a umožnil detailní pochopení determinantů určujících ligandovou specifitu nikotinového receptoru. Místa pro vazbu agonistů se nacházejí na rozhraních podjednotek, ale ve svalu se vyvinuly pouze dvě z pěti rozhraní podjednotek, a g a d, které vážou ligandy. Vazba agonistů, reverzibilních kompetitivních antagonistů a elapidového toxinu a se vzájemně vylučuje a zahrnuje překrývající se plochy na receptoru. Obě podjednotky tvořící rozhraní podjednotky přispívají k ligandové specifitě. Měření membránových vodivostí ukazují, že rychlost translokace iontů je dostatečně rychlá (5×107 iontů za sekundu), aby vyžadovala translokaci iontů otevřeným kanálem, a nikoli rotujícím nosičem iontů. Navíc změny propustnosti iontů zprostředkované agonisty (typicky pohyb dovnitř primárně Na+ a sekundárně Ca2+) probíhají přes kationtový kanál, který je vlastní struktuře receptoru. Druhá transmembránově se rozprostírající oblast na každé z pěti podjednotek tvoří vnitřní obvod kanálu. Místo pro vazbu agonisty je úzce spojeno s iontovým kanálem; ve svalovém receptoru vede současná vazba dvou molekul agonisty k rychlé konformační změně, která kanál otevře. Jak vazebná, tak hradící reakce vykazují pozitivní kooperativitu. Podrobnosti o kinetice otevírání kanálu se vyvinuly z elektrofyziologických technik patch-clamp, které rozlišují jednotlivé události otevírání a zavírání jedné molekuly receptoru a potvrzují, že nikotinové acetylcholinové receptory (nAChR) jsou pentamerické ligandgated iontové kanály, které se skládají z podjednotek, které se skládají z extracelulární domény, která nese vazebné místo pro ligand, a z odlišné domény s iontovými póry. Přenos signálu je výsledkem alosterické vazby mezi těmito dvěma doménami, jejichž vzdálenost od vazebného místa k bráně pórové domény je 50 Å. Studie vazby receptorů jsou však specifické pro nikotinové cholinergní receptory, které byly provedeny na izolovaných vestibulárních epitelích žab Rana catesbiana a Rana temporaria. Jsou předloženy důkazy o přítomnosti nikotinových cholinergních receptorů specificky spojených se senzorickými oblastmi a studována vazba atypických nikotinových agonistů konformních s podtypovou selektivitou a dochází se k závěru, že nAChR má klíčovou roli v excitační neurotransmisi a hraje důležitý cíl pro léčiva a insekticidy. Rozmanité podtypy nAChR s různými kombinacemi podjednotek propůjčujícími rozdílnou selektivitu pro nikotinové léky a také identifikoval rodinu genů kódujících proteiny homologní s α podjednotkou svalového nikotinového acetylcholinového receptoru v genomu potkana. Tyto geny jsou transkribovány v centrálním a periferním nervovém systému v oblastech, o nichž je známo, že obsahují funkční nikotinové receptory. Úloha, kterou hrají neuronální nikotinové receptory obsahující β2 (nAChR) při zprostředkování vedlejších účinků nikotinu u plodu a novorozence. Těhotným WT a mutantním myším s nedostatkem podjednotky β2 nAChR byly implantovány osmotické minipumpy, které dodávaly buď vodu, nebo kontrolovanou dávku nikotinu. Následně došlo ke srovnání vývoje sympatoadrenálního systému a dýchacích a vzrušivých reflexů potomků krátce po narození, tedy v období zvýšené zranitelnosti vůči expozici nikotinu. Na druhé straně jsou neonikotinoidy, stejně jako imidakloprid, agonisty nAChR se silnou insekticidní aktivitou. Od svého uvedení na trh počátkem 90. let 20. století se imidakloprid stal jedním z nejrozšířenějších insekticidů používaných jak pro ochranu plodin, tak pro veterinární aplikace, molekulární základ rezistence vůči imidaklopridu, pět podjednotek nAChR (Nlα1-Nlα4 a Nlβ1) bylo naklonováno z Nilaparvata lugens. Porovnáním genů podjednotek nAChR z populací citlivých na imidakloprid a rezistentních na imidakloprid byla zjištěna jediná bodová mutace na konzervovaném místě (Y151S) ve dvou podjednotkách nAChR, Nlα1 a Nlα3. Pomocí alelově specifické PCR byla prokázána silná korelace mezi frekvencí bodové mutace Y151S a úrovní rezistence k imidaklopridu. Expresí hybridních nAChR obsahujících podjednotky α Nilaparvata lugens a β2 potkana byly získány důkazy, které prokazují, že mutace Y151S je zodpovědná za podstatné snížení specifické vazby na imidakloprid. Tato studie poskytuje přímý důkaz o výskytu rezistence cílového místa vůči neonikotinoidnímu insekticidu a zkoumala o povaze vazebného místa kation-π v nikotinovém receptoru a zjistila, že nikotinový acetylcholinový receptor je prototypem ligandem řízeného iontového kanálu. Bylo identifikováno několik aromatických aminokyselin, které se podílejí na vazebném místě agonisty, což naznačuje, že interakce kation-π se mohou podílet na vazbě kvartérní amoniové skupiny agonisty, acetylcholinu. Konformace cholinergních molekul na nikotinových nervových receptorech a nachází korelaci analýz krystalové struktury silných nikotinových agonistů acetylcholinu, acetyl-α-metylcholinu, laktoylcholinu, 1,1-dimetyl-4-fenylpiperazinu a nikotinu umožňuje určit konformaci cholinergních agonistů relevantních pro nikotinové nervové receptory. Exprese neurotransmiterových receptorů kódovaných mRNA izolovanými ze tří lidských gliomových buněčných linií. Oocyty injektované mRNA ze dvou buněčných linií glioblastomu nevykazovaly elektrické odpovědi na různé testované neurotransmitery.
Modulací nAChR strychninem bylo zjištěno, že strychnin je silný a selektivní antagonista na glycinových receptorech, který inhibuje svalové (α 1β 1γ δ, α 1β 1γ a α 1β 1δ) a neuronální (α 2β 2 a α 2β 4) nikotinové acetylcholinové receptory (AcChoRs) exprimované v oocytech Xenopus. Samotný strychnin (do 500 µmol/l) nevyvolal u oocytů exprimujících AcChoRs membránové proudy, ale pokud byl aplikován před, současně nebo během superfúze acetylcholinu (AcCho), rychle a reverzibilně inhiboval proud vyvolaný AcCho (AcCho-proud). Překlad exogenní messengerové RNA kódující nAChR produkuje funkční receptory v oocytech Xenopus, v této studii byla messengerová RNA extrahovaná z elektrického orgánu Torpedo injikována do oocytů Xenopus. To vedlo k syntéze a zabudování funkčních acetylcholinových receptorů do membrány oocytu. Po aktivaci acetylcholinem tyto Torpedovy acetylcholinové receptory v membráně oocytu otevřely kanály, jejichž iontová propustnost se podobala nikotinovým receptorům v jiných buňkách.
Lokalizace acetylcholinových receptorů (AChR) na povrchu vyvíjejících se myogenních buněk předních a zadních svalů latissimus dorsi kuřecího embrya ve vztahu k procesu inervace byla studována na ultrastrukturální úrovni s využitím konjugátu křenové peroxidázy a α-bungarotoxinu. Lokalizované koncentrace AChR byly nalezeny v malých oblastech 0,1-0.4 µm široké na povrchu myogenních buněk 10 až 14 dní starých svalů a také byly studovány účinky acetylcholinu a látek, které napodobují nebo blokují jeho fyziologické účinky, na koncentraci guanosinu 3′:5′-cyklického monofosfátu (cyklického GMP) a adenosin 3′:5′-cyklického monofosfátu (cyklického AMP) v řezech mozkové kůry savců, srdeční komory a ilea. Acetylcholin a cholinomimetické látky s převážně muskarinovým účinkem, jako je metacholin, bethanechol a pilokarpin, vyvolaly ve všech třech studovaných tkáních zvýšení koncentrace cyklického GMP nebo mírné snížení koncentrace cyklického AMP.
Funkční vlastnosti a buněčná lokalizace lidského neuronálního receptoru α7 AcCho (α7 AcChoR) a jeho mutované formy L248T (mut) byly zkoumány jejich expresí samostatně nebo jako genové fúze s rozšířenou verzí zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). Xenopus oocyty injikované cDNA divokého typu, mutα7 nebo chimérické podjednotky exprimovaly receptory, které při působení AcCho hradily membránové proudy. Jak je již známo, proudy AcCho generované receptory wtα7 se rozpadají mnohem rychleji než proudy vyvolané receptory mutα7. Souhra β2 nikotinových receptorů a dopaminových drah v řízení spontánní lokomoce a zjistí, že acetylcholin (ACh) je známým modulátorem aktivity dopaminergních (DAergních) neuronů prostřednictvím stimulace nAChRs. Přesto složení podjednotek a specifické umístění nAChRs, které se podílejí na lokomoci zprostředkované DA, dosud nebylo in vivo stanoveno. Myši, kterým chybí podjednotka β2 nAChRs (β2KO), vykazují nápadnou hyperaktivitu v otevřeném poli, což naznačuje nerovnováhu v neurotransmisi DA. Mutace v doméně M2 nikotinového receptoru však převádí 5-hydroxytryptamin z antagonisty na agonistu, byla provedena studie účinků 5-hydroxytryptaminu (5HT) na homomerní neuronální nikotinové receptory (nAcChoR) exprimované v oocytech Xenopus po injekci cDNA kódující kuřecí podjednotku divokého typu. AcCho vyvolával velké proudy, které byly redukovány 5HT reverzibilně a v závislosti na dávce, s poloviční inhibiční koncentrací a Hillovým koeficientem. Ačkoli studium cholinergního receptoru cytotoxických T lymfocytů a cholinergních agonistů má schopnost senzibilizovaných lymfocytů poškozovat buňky nesoucí senzibilizující aloantigeny, cholinergní receptor útočící populace lymfocytů byl studován pomocí farmakologické manipulace systému in vitro, který kvantifikuje poškození zprostředkované senzibilizovanými útočícími buňkami na cílové buňky.
.