Diskuse
Jedním z nejzávažnějších problémů spojených s léčbou infekcí způsobených C. striatum je izolace multirezistentních kmenů z klinického materiálu a výběr vhodné antibiotické terapie pro daný typ infekce. Infekce vyvolané C. striatum by měly být léčeny podle výsledků testů citlivosti. Mnohočetná rezistence k léčivům je způsobena souhrou více mechanismů rezistence, které vznikají získáním cizích determinant rezistence nebo spontánními mutacemi. Tato práce poukazuje na vysokou prevalenci multirezistentních kmenů a genů rezistence mezi C. striatum izolovanými v nemocnici v Tunisku, zejména na rezistenci k aminoglykosidům, sloučeninám ze skupiny MLSB, fluorochinolonům a β-laktamům.
63 C. striatum analyzovaných v této studii bylo citlivých na vankomycin a linezolid. V dřívější zprávě s použitím diskové difuzní metody Martinez et al.19 prokázali, že 31 C. striatum izolovaných z klinických vzorků bylo citlivých na vankomycin. Nedávno Gomila et al.20 uvedli, že jejich 52 C. striatum izolovaných od pacientů s chronickou obstrukční respirační chorobou bylo citlivých i na vankomycin. Vankomycin je dodnes účinný, a proto představuje vhodnou možnost léčby závažných infekcí způsobených C. striatum. Vynikající aktivitu vykazuje také linezolid, jehož MIC jsou běžně nižší než 0,5 mg/l21. Gómez-Garcés a spol.22 prokázali, že vankomycin a linezolid jsou stejně účinné proti 30 klinickým C. striatum (MIC90 obou sloučenin = 0,5 mg/l). Linezolid lze považovat za alternativu vankomycinu proti C. striatum, i když je třeba zvážit jeho vedlejší účinky během dlouhých cyklů léčby, které jsou nutné u infekcí spojených s hardwarem nebo přístroji. Všechny naše C. striatum byly citlivé na daptomycin (MIC90 = 0,25 mg/l). Bylo prokázáno, že daptomycin je účinný i proti C. striatum, a to samostatně23 nebo v kombinaci s rifampicinem24. Proto lze daptomycin také považovat za alternativu vankomycinu při léčbě infekcí vyvolaných C. striatum, ačkoli byl nedávno zaznamenán rychlý vznik rezistence k daptomycinu vysoké úrovně25, 26.
Aminoglykosidy se používají jako doplňková antibiotika k léčbě závažných infekcí vyvolaných difteroidy. Z aminoglykosidů vykazovaly amikacin a gentamicin dobrou aktivitu „in vitro“ proti naší C. striatum (MIC90 = 1, resp. 2 mg/l). Rezistence k aminoglykosidům vzniká několika mechanismy, které mohou existovat současně v téže buňce. Enzymatická inaktivace molekuly antibiotika je v klinickém prostředí nejčastější. Gen aac(3)-XI, který kóduje aminoglykosid 3-N acetyltransferázu propůjčující rezistenci ke gentamicinu a tobramycinu u C. striatum27 , nebyl u našich 3 izolátů rezistentních ke gentamicinu nalezen, což naznačuje, že rezistence je zprostředkována jiným mechanismem. Kanamycin a streptomycin se v klinické praxi v Tunisku nepoužívají, ale v této studii byly testovány, protože jsou dobrými markery pro detekci přítomnosti genů aph(3′)-Ic, aph(3″)-Ib a aph(6)-Id. Gen aph(3′)-Ic, který kóduje aminoglykosid-O-fosfotransferázu, jež se podílí na rezistenci ke kanamycinu, neomycinu, paromomycinu, ribostamycinu a lividomycinu, je součástí větší oblasti DNA obsahující tandemový pár genů rezistence aph(3″)-Ib – aph(6)-Id, který propůjčuje Corynebacterium spp28 rezistenci ke streptomycinu. Identické oblasti rezistence k aminoglykosidům byly nalezeny v plazmidu pTP10 z C. striatum v těsné blízkosti oblastí rezistence k erytromycinu a chloramfenikolu29. Podle očekávání neslo 10 C. striatum rezistentních ke kanamycinu gen aph(3′)-Ic. Tento gen byl však zjištěn i u kmenů citlivých ke kanamycinu, pravděpodobně v důsledku mutací ovlivňujících jeho kódující sekvenci nebo promotor. Tyto výsledky potvrzují, že gen aph(3′)-Ic je u Corynebacterium spp. rozšířen. Rezistence ke streptomycinu u Corynebacterium spp. souvisí s přítomností tandemu genů aph(3″)-Ib a aph(6)-Id, které kódují aminoglykosid-3″-fosfotransferázu, resp. aminoglykosid-6-fosfotransferázu28. Pět z osmi izolátů rezistentních ke streptomycinu neslo geny aph(3″)-Ib a aph(6)-Id a zbývající tři měly MIC pro streptomycin v rozmezí 1 až 4 mg/l, pravděpodobně v důsledku mutací ve výše uvedených genech nebo v jejich promotoru. K rezistenci vůči streptomycinu u těchto izolátů mohou přispívat i další mechanismy, jako je aktivní eflux antimikrobiální látky a snížený příjem do bakteriální buňky. Amikacin je nakonec předepisován v kombinované terapii proti závažným infekcím způsobeným C. striatum v nemocnici FHU. Naše výsledky naznačují, že amikacin je vhodnější aminoglykosid pro léčbu infekcí vyvolaných C. striatum, zatímco gentamicin by mohl být platnou alternativou. Výskyt rezistentních kmenů však vyžaduje neustálou ostražitost.
Erytromycin a klindamycin byly neúčinné proti většině našich C. striatum, zejména klindamycin s MIC90 osmkrát vyšší než u erytromycinu. Tato skutečnost potvrzuje dříve uváděnou vysokou prevalenci rezistence vůči sloučeninám ze skupiny MLSB mezi Corynebacterium spp. včetně C. striatum30. Rezistence k MLS u Corynebacterium spp. je nejčastěji zprostředkována dvěma mechanismy: modifikací cílového místa zprostředkovanou metylasami ribozomální RNA kódovanými tzv. erm geny a aktivním efluxem léčiva zprostředkovaným membránovou efluxní pumpou kódovanou genem mef(A-E)31. Naše výsledky potvrdily výsledky předchozích studií, které poukázaly na to, že erm(X) je nejdůležitějším genem podílejícím se na rezistenci k MLS u Corynebacterium spp29, 32. Poprvé jsme u C. striatum detekovali gen erm(B) kódující metylázu ribozomální RNA Erm(B). Gen erm(B) propůjčuje vysokou úroveň rezistence k makrolidům u Campylobacter coli33 a dalších příslušných patogenů, ale u Corynebacterium spp. je výjimečný31, 34. Deset našich kmenů neslo geny erm(B) a erm(X) současně, což je vlastnost dříve popsaná pouze u jednoho kmene C. urealyticum31.
Třetina našich kmenů C. striatum vykazovala střední nebo vysokou úroveň rezistence k ciprofloxacinu a moxifloxacinu. Fluorochinolony byly v nemocnici FHU intenzivně používány v posledních dvou desetiletích. Při podávání antibiotik vzniká selektivní tlak v tělesných orgánech, kde mají fluorochinolony tendenci se hromadit. Působením fluorochinolonů dochází k selekci spontánních mutant ve velkých populacích bakterií, včetně těch, které kolonizují kůži a sliznice, jako jsou korynebakterie. Rezistence na fluorochinolony se tak objevila u klinických izolátů C. striatum a C. amycolatum35. Rezistence k fluorochinolonům u Corynebacterium spp. je způsobena mutacemi v QRDR genu gyrázy gyrA. U našich kmenů jednotlivé aminokyselinové záměny v poloze 87 proteinu gyrA vytvářely rezistenci k ciprofloxacinu, ale dvojité mutace v genu gyrA vedoucí ke změnám v polohách 87 a 91 byly nezbytné pro vysokou úroveň rezistence k ciprofloxacinu a moxifloxacinu. U čtrnácti z 21 genů C. striatum rezistentních vůči fluorochinolonům souviselo zvýšení MIC ciprofloxacinu a moxifloxacinu až na 16 mg/l s dvojitou nekonzervativní mutací v polohách 87 a 91. Na základě těchto mutací bylo zjištěno, že v genomu GyrA došlo ke zvýšení MIC ciprofloxacinu a moxifloxacinu. Sierra a spol.35 rovněž zaznamenali dvojité mutace v polohách 87 a 91 v genu gyrA u šesti kmenů C. striatum, ačkoli MIC moxifloxacinu u jejich kmenů byly nižší (6-8 mg/l). Pět našich kmenů s jednoduchými mutacemi na pozicích 87 nebo 91 je stále rezistentních k ciprofloxacinu, i když s nižšími MIC (v rozmezí 2-8 mg/l), zatímco MIC moxifloxacinu zůstaly na 1 mg/l. Jednotlivé mutace v reziduu Ser-87 nebo v reziduu Asp-91 popsané Sierrou a spol.35 zvýšily MIC ciprofloxacinu na 1-6 mg/l, zatímco k moxifloxacinu zůstaly citlivé. Vyšší úroveň rezistence k moxifloxacinu u našich kmenů naznačuje existenci dalšího mechanismu rezistence kromě mutací v gyrA. U dvou kmenů nebyly zjištěny žádné změny v jejich QRDR, což naznačuje, že rezistence byla zprostředkována jiným mechanismem.
β-laktamy jsou nejrozšířenější třídou antimikrobiálních látek. Byla zaznamenána úspěšná léčba infekcí vyvolaných C. striatum pomocí penicilinu36 nebo amoxicilinu37. Byla však sdělena nízká citlivost k penicilinu a cefotaximu mezi ostatními β-laktamy10, 38 , ačkoli genetický mechanismus rezistence nebyl dosud charakterizován. Vzhledem k hodnotám MICs90 (16 mg/l) vykazovaly penicilin a cefotaxim stejně nízkou aktivitu vůči našemu C. striatum. Skutečnost, že míra výskytu kmenů rezistentních k penicilinu je vyšší než míra výskytu kmenů rezistentních k cefotaximu, se vysvětluje tím, že CLSI breakpoint citlivosti pro penicilin byl nedávno snížen z 1 mg/l na 0,125 mg/l39 . Hydrolýza β-laktamových antibiotik β-laktamázami je nejčastějším mechanismem rezistence této třídy antibakteriálních látek u klinicky významných bakterií. β-laktamázy jsou klasifikovány podle sekvence proteinů do čtyř molekulárních tříd, A, B, C a D, na základě konzervovaných a rozlišujících aminokyselinových motivů. Padesát dva našich kmenů bylo rezistentních k penicilinu a tato rezistence souvisela s přítomností genu bla kódujícího β-laktamázu třídy A. Chromozomy Corynebacterium jeikeium K41140, Corynebacterium urealyticum DSM 710941 a Corynebacterium resistens DSM 4510042 kódují odpovídající protějšky bla genu C. striatum, ačkoli u těchto druhů nebyl spojen s rezistencí k β-laktamům. Gen ampC, kódující β-laktamázu třídy C, byl zjištěn u 42 z 52 druhů C. striatum rezistentních k penicilinu. Geny ampC, které jsou mezi Enterobacteriaceae široce rozšířené, kódují enzymy aktivní jak na peniciliny, tak na cefalosporiny43. Zde ukazujeme, že u C. striatum rezistentní k β-laktamázám jsou přítomny dva geny kódující β-laktamázu, bla a ampC. Naše údaje odhalily vysokou míru rezistence k β-laktamům a vysokou prevalenci genů bla a ampC mezi C. striatum izolovanými v naší nemocnici. Tyto údaje jsou cenné pro praktické lékaře a odrazují od používání β-laktamových sloučenin při léčbě infekcí způsobených C. striatum.
PFGE je považována za zlatý standard v epidemiologických studiích patogenních mikroorganismů a poskytuje důležité poznatky o jejich populační struktuře44. Naše výsledky ukázaly 22 odlišných vzorů PFGE od 63 kmenů C. striatum. Vysoká diverzita genotypů mezi 63 kmeny C. striatum odhalila, že většinou nejsou úzce příbuzné. Proto může C. striatum v nemocnici FHU pocházet z různých linií a zdrojů namísto expanze jedné klonální linie. To odpovídá patogennímu stavu C. striatum jako oportunního patogenu, který způsobuje příležitostná onemocnění u predisponovaných pacientů. Některé PFGE vzorce byly izolovány častěji, což naznačuje existenci několika rozšířenějších klonů. Vzory E a A považujeme za pulsotypy s vysokou prevalencí. Většina C. striatum přiřazených k pulzotypům E a A byla vysoce rezistentní, což naznačuje, že nejrozšířenější klony jsou vysoce rezistentní, jak bylo již dříve uvedeno10, 16. Skutečnost, že mezi kmeny patřícími k určitému PFGE vzoru bylo možné rozlišit mnoho různých profilů rezistence k antibiotikům, odhalila, že se nejedná o jediný kmen, ale o několik úzce příbuzných klonů produkujících sporadické infekce.
Závěrem lze říci, že tato studie poukazuje na význam C. striatum jako nově se objevujícího multirezistentního nozokomiálního patogenu v nemocnici FN HK. Izoláty C. striatum vykazovaly 100% citlivost na vankomycin, linezolid a daptomycin a vysokou míru rezistence na rifampicin, sloučeniny skupiny MLSB, fluorochinolony a β-laktamy. Mezi několika klony C. striatum kolujícími v nemocnici FHU převažovaly ty nejrezistentnější. Proto je třeba pokračovat ve sledování MDR C. striatum
.